Grao en Bioquímica

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Estudio de la conversión de GTX2,3 en matrices de moluscos de origen gallego
(2025) Vázquez Díaz, Brendán; Universidade de Santiago de Compostela. Facultade de Ciencias
[SPA] Las ficotoxinas son compuestos tóxicos generados por microalgas en las floraciones de algas nocivas. Con el cambio climático, estas floraciones han aumentado su frecuencia de aparición e intensidad, acumulando grandes concentraciones de toxinas marinas en el agua, y afectando negativamente al resto de organismos presentes en el ecosistema. Entre las diversas ficotoxinas que producen las microalgas, destacan las PSP, unas de las neurotoxinas más potentes conocidas, que provocan al ingerirlas el síndrome paralizante de moluscos. Los humanos pueden sufrir esta intoxicación al consumir moluscos bivalvos que se encuentren en agua contaminada. Los moluscos filtran el agua, y en el proceso, retienen las toxinas PSP provocando que pueda ser letal su consumo. Por ello, hay una normativa europea de las PSP en alimentos marinos que establece las máximas concentraciones de toxinas que se pueden detectar en un molusco para un consumo seguro. Sin embargo, detectar una toxina PSP en agua no implica que se vaya a detectar en el molusco recogido en ese medio. Hay evidencias de varias especies de moluscos bivalvos que son capaces de transformar en su matriz unas toxinas PSP en otras mediante procesos enzimáticos, por lo que resulta indispensable conocer qué transformaciones lleva a cabo cada especie para establecer su seguridad, desde el punto de vista del riesgo de ingestión durante el consumo de moluscos. En este trabajo, se analiza qué transformaciones llevan a cabo dos de las especies más comercializadas en Galicia, Venerupis corrugata y Ensis magnus. En concreto, se analiza la capacidad para transformar las toxinas GTX2,3, y los resultados obtenidos indican una diferencia notable entre los dos moluscos. En Venerupis corrugata no se encontraron indicios de transformación, mientras que en Ensis magnus se observó la conversión de GTX2,3 a C1,2, una transformación encontrada únicamente en dinoflagelados hasta el momento, pero no en otros moluscos.
Mutaxénese de xenes pertencentes ao resistoma secundario de E. coli resistente a cefotaxima
(2025) Somoza García-Losa, Yago
[SPA] La resistencia a agentes antimicrobianos en bacterias es uno de los principales problemas de salud a nivel mundial y se estima que debido a la difusión masiva de genes de resistencia entre cepas este problema aumente cada vez más. Dentro de los patógenos considerados como críticos por la Organización Mundial de la Salud, frente a los que es urgente descubrir nuevas terapias, se encuentra Escherichia coli resistente a cefalosporinas de 3ª generación, como la cefotaxima (CTX); resistencia que puede deberse a la producción de β-lactamasas de espectro extendido. El presente estudio tiene como objetivo comprobar el efecto sobre la resistencia a cefotaxima de un gen perteneciente al resistoma secundario frente a este antimicrobiano en cepas clínicas de Escherichia coli productoras de la enzima CTX-M-1. Para ello, se llevó a cabo la mutagénesis del gen ybeD en dos cepas clínicas de Escherichia coli blaCTX-M-1 positivas, de origen humano y animal. Posteriormente se determinó la concentración mínima inhibitoria (MIC) de CTX en cada cepa, tanto salvajes como mutantes; mostrando una reducción en la MIC para los mutantes en comparación con la cepa salvaje correspondiente. Además, se realizó un ensayo de cinética de muerte bacteriana de 0 a 24 horas, empleando todas las cepas en estudio y creciéndolas en un medio suplementado con CTX—aproximadamente ½ de la MIC en las cepas salvajes. En este ensayo se observó una reducción inicial en el crecimiento y supervivencia de cada cepa mutante respecto a la salvaje, y una recuperación a las 24 horas. En conclusión, los resultados sugieren que el gen ybeD está involucrado en la resistencia a cefotaxima, ya que su deleción reduce la resistencia a dicho antibiótico. Es importante destacar que la reducción es menor que la obtenida previamente en una cepa de referencia de E. coli portadora del gen blaCTX-M-1.
Desenvolvemento de novas tecnoloxías para o illamento de exosomas mediante o uso de sistemas biolóxicos vivos
(2025) Pita Bea, Alejandro
[GLG] Os exosomas son un tipo de vesículas extracelulares cuxa bioxénese ocorre na vía endosómica da célula. A súa secreción é un proceso evolutivamente conservado e sábese que desenvolven un papel crucial na comunicación intercelular. Estas vesículas, transportan proteínas transmembrana ou compoñentes citoplasmáticos, o que amosa o seu potencial como biomarcadores non invasivos para o diagnóstico de diversas patoloxías como o cancro. Non obstante, na actualidade os protocolos son moi complexos e custosos, polo que se require desenvolver novas técnicas. Neste estudo, búscase crear un novo protocolo que permita illar exosomas humanos mediante o emprego da tecnoloxía de presentación en superficie de lévedos, que permite a expresión de proteínas recombinantes na parede celular. Neste caso, o dominio extracelular de Tim4 (Tim4D), que ten a capacidade de recoñecer residuos de fosfatidilserina presentes na membrana dos exosomas. Tim4D foi clonado nos plásmidos pYD1, pYD5 e pCTcon2 e expresado na cepa EBY100 de S.cerevisiae, co obxectivo de validar o seu uso como sistema de captura de exosomas. Os procedementos incluíron clonación por recombinación homóloga, transformación bacteriana e en lévedos, e análise da expresión mediante técnicas como Western Blot, Dot Blot e citometría de fluxo. A expresión de Tim4D na superficie dos lévedos suxire que esta metodoloxía podería ser unha alternativa viable, barata e eficiente aos métodos tradicionais de illamento de exosomas. Con todo, o emprego de técnicas máis complexas e a análise dos reactivos que compoñen os medios de cultivo mellorarían a detección da expresión da proteína de fusión para a aplicación dos exosomas en investigación biomédica e terapias baseadas en vesículas extracelulares.
Estudo da resposta do hóspede vexetal contra o patóxeno Botrytis cinerea
(2025) Pérez Antelo, Paula
[SPA] Actualmente el tomate es un cultivo de gran importancia económica en todo el mundo. Un patógeno que produce grandes pérdidas económicas al atacar este cultivo es Botrytis cinerea, un patógeno fúngico necrotrófico que causa lesiones necróticas en el tejido infectado. Se busca estudiar la interacción entre B. cinerea y su huésped S. lycopersicum. Para ello, se analizó el cambio en los niveles de expresión de genes implicados tanto en el mecanismo de ataque del patógeno (BcNep1, BcPg6), como en el mecanismo de defensa del huésped (SlEt4, SlPat, SlCas3, SlDcd2). Se diseñaron cebadores para los genes a estudiar y, mediante técnicas microbiológicas, se realizó el cultivo del patógeno, Botrytis cinerea. Este cultivo del hongo se utilizó para la preparación de inóculos, los cuales se aplicaron sobre la planta huésped, S. lycopersicum, para obtener muestras de tejido infectado. De estos tejidos se extrajo el ARN que, una vez retrotranscrito a ADNc, se analizó empleando la técnica de la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Los resultados obtenidos mostraron una variación en los niveles de expresión génica frente a los observados en las muestras control. Se observó la sobreexpresión de genes de Botrytis implicados en el proceso de virulencia (BcNep1, BcPg6) y de genes de Solanum implicados en la inmunidad vegetal, como son la producción de la fitohormona vegetal etileno (SlEt4), o proteínas de defensa (SlPat). En Solanum también se observó la expresión diferencial de los genes relacionados con la muerte celular, una metacaspasa (SlCas3) y una proteína relacionada con la respuesta hipersensible (SlDcd2). Estas dos proteínas representan dos tipos de muerte celular antagónicos en los que Botrytis parece estar involucrado, observándose sobreexpresión de la metacaspasa y represión de la respuesta hipersensible (HR).
Determinación de la capacidad antimicrobiana de películas biodegradables enriquecidas con metalo compuestos iónicos de Mn(III) para su aplicación como envase alimentario
(2024) Pascual De La Cruz, Susana
[SPA] La OMS estima que los alimentos contaminados afectan a 600 millones de personas y causan 420.000 muertes anuales. En este contexto, la contaminación bacteriana en productos lácteos representa una de las mayores amenazas para la seguridad alimentaria con brotes asociados a Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. Con el objetivo de contribuir a la seguridad alimentaria este trabajo de Fin de Grado tuvo como objetivo evaluar la capacidad antimicrobiana de un complejo manganosalen (MnC23O7N2H29) con el fin de introducirlo en envasas comestibles biodegradables. Para ello se realizaron distintos ensayos incluyendo, la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI), pruebas de difusión en agar mediante aplicación en gota, tanto del compuesto individual como combinado con el quitosano a distintas concentraciones, y ensayo de cinética de muerte bacteriana utilizando cepas de las especies mencionadas. La CMI de MnC23O7N2H29 fue de 0,469 mg/mL (S. aureus y S. enterica), 1,094 mg/mL (STEC) y 1,25 mg/mL (L. monocytogenes). Los ensayos de difusión mostraron halos de inhibición a concentraciones iguales o superiores a 5 mg/mL en las cuatro cepas evaluadas, siendo S. aureus la más resistente al complejo. La combinación de MnC23O7N2H29 con quitosano no evidenció efecto sinérgico, observándose que la inhibición correspondía principalmente al quitosano. El crecimiento bacteriano en presencia de 5 mg/mL del complejo disminuyó significativamente en comparación con el control durante las 3, 6 y 24 h de estudio. Se observó efecto bactericida (reducción igual o superior a 3 log) a las 6 h en todas las cepas, excepto en S. enterica, donde se alcanzó a las 24 h. Los resultados muestran una actividad antimicrobiana dependiente de la cepa o especie, y sugieren que el complejo es un agente prometedor para su incorporación en matrices alimentarias. No obstante, se requieren estudios adicionales para confirmar su eficacia en condiciones reales.
Desenvolvemento e caracterización de liñas celulares de peixe cebra en estadios embrionarios e adultos, tanto de tipo salvaxes como mutantes, para aplicacións en estudos bioquímicos e moleculares
(2025) Lyon Bonucci, Veronica Andreina
[SPA] El desarrollo y la caracterización de líneas celulares de pez cebra requiere de la elaboración de un protocolo que facilite su establecimiento. Actualmente existen pocas metodologías optimizadas para este modelo, a pesar de su creciente importancia en investigación biomédica y genética. Este trabajo tiene como objetivo diseñar una metodología para generar cultivos celulares a partir de embriones y peces cebra adultos, tanto de tipo salvajes como mutantes. La finalidad común es la estandarización de las condiciones óptimas para el cultivo de sus células, independientemente del genotipo de origen. Se evaluaron distintas condiciones de disgregación celular, utilizando enzimas proteolíticas como tripsina y pronasa y se utilizó medio de cultivo L-15, suplementado con distintas concentraciones de FBS, y bajo diferentes formas de esterilización. También, se exploró la transformación vírica con retrovirus SnRV como estrategia de inmortalización. Se llevaron a cabo ensayos de cultivo celular a partir de embriones en estadios de 30% y 50% de epibolia, estadio de yema y fase faringular Prim-5, con el fin de preservar su viabilidad celular, evitando el desarrollo de embriones hasta etapas más avanzadas y, de este modo, reduciendo el uso de animales en la experimentación. Asimismo, se iniciaron ensayos para el desarrollo de líneas celulares derivadas de corazón, intestino, ojos, músculo y cerebro extraído de peces cebra adultos, comparando individuos salvajes y mutantes. Aunque se logró la siembra inicial y se observaron signos tempranos de adherencia y viabilidad en algunas condiciones, la mayoría de los cultivos no consiguieron mantenerse de forma estable a largo plazo. Con todo, este trabajo sienta las bases metodológicas para futuras optimizaciones orientadas al establecimiento efectivo de líneas celulares. Este proyecto no solo contribuye al avance del conocimiento en biomedicina, sino que también promueve un enfoque más ético y sostenible en la investigación científica.
Identificación de proteínas fosforiladas por a proteína quinasa dependente de AMPc en espermatozoides de mexilón Mytilus galloprovincialis
(2025) López Cabanas, Lorena María
[GLG] As modificacións postraducionais que sofren as proteínas tras a súa síntese, entre elas a fosforilación, son factores determinantes para a súa funcionalidade. As proteína quinasas e proteína fosfatasas catalizan o proceso de fosforilación reversible nas proteínas. Unha das proteína quinasas máis estudadas é a proteína quinasa dependente de AMPc (proteína quinasa A; PKA), implicada na regulación de numerosos procesos fisiolóxicos. En mamíferos, a PKA desempeña un papel clave na regulación da motilidade espermática, catalizando a fosforilación de diferentes proteínas estruturais do flaxelo, enzimas do metabolismo enerxético ou factores reguladores da expresión xénica. Con todo, en moitos organismos invertebrados con fecundación externa, como os moluscos bivalvos, non existe apenas información acerca da implicación da PKA na regulación deste proceso. Utilizando o mexillón Mytilus galloprovincialis como especie modelo, neste traballo propuxémonos como obxectivo identificar proteínas presentes nos espermatozoides que son fosforiladas in vitro por esta enzima, concretamente, pola isoforma C4, específica destas células. Mediante estudos de proteómica (LC-MS/MS), identificáronse como substratos da PKAaproximadamente 100 proteínas presentes en lisados espermáticos. Entre estas, a maioría son proteínas cun papel estrutural presentes nos flaxelos, destacando fundamentalmente diferentes isoformas da cadea pesada da dineína axonémica; ademais, tamén se identificaron proteínas implicadas no metabolismo enerxético, concretamente, rutas de obtención de ATP; e outras relacionadas con cascadas de sinalización e con procesos de síntese e degradación de proteínas. Os resultados obtidos suxiren que, ao igual que acontece en mamíferos, a PKA parece desempeñar un papel clave na regulación da motilidade espermática en organismos con fecundación externa, como son os moluscos bivalvos.
Avaliación dun novo composto contra o glioblastoma múltiple (GBM) in vivo mediante o uso de liñas humanas establecidas
(2025) López Anca, Mateo
[SPA] El glioblastoma multiforme (GBM) es el tumor cerebral primario más frecuente y agresivo del sistema nervioso central en adultos. Su alta tasa de proliferación, capacidad invasiva, heterogeneidad molecular y resistencia terapéutica hacen que su pronóstico sea extremadamente desfavorable, con una media de supervivencia inferior a los 15 meses, incluso tras recibir un tratamiento óptimo. Frente a esta situación, es imprescindible la búsqueda de nuevos compuestos terapéuticos que ofrezcan alternativas más eficaces. Con los avances a nivel molecular, la reciente ampliación de conocimientos a cerca de la gran heterogeneidad del GBM y el desarrollo de la medicina de precisión, así como la aparición de modelos in vivo alternativos a los más tradicionales, hace que cada vez seamás fácil el desarrollo de nuevos compuestos. A partir de la década de 1970 comienza a emplearse, de forma extendida, el pez cebra (Danio rerio) como modelo animal, convirtiéndose en un organismo prometedor para la investigación biomédica debido a sus ventajosas características biológicas y genéticas, al igual que por facilidades económicas y logísticas, ideales para la investigación. Durante la última década, el pez cebra ha sido de gran utilidad como modelo in vivo para la realización de ensayos de xenotrasplante, particularmente de tumores de GBM, debido a su utilidad en los experimentos in vivo, permitiendo estudiar las interacciones del tumor con el ambiente, crecimiento tumoral, invasión y, en general, la fisiopatología del GBM. Asimismo, también permite la evaluación de toxicidad y efectividad de compuestos terapéuticos en ensayos preclínicos, pudiendo estudiar su respuesta frente al GBM. A raíz de lo expuesto, en este trabajo se trató de evaluar in vivo el potencial terapéutico de un compuesto experimental (GBM48) utilizando embriones de pez cebra como modelo de xenotrasplante, así como de validar el pez cebra como modelo preclínico. Los resultados obtenidos refuerzan al pez cebra como una herramienta ideal para el análisis, rápido y eficaz, de terapias innovadoras frente al GBM y acorta la distancia entre el conocimiento molecular y genético del tumor y su aplicación clínica, convirtiéndose en una vía prometedora para el desarrollo de nuevos tratamientos personalizados para pacientes que padezcan esta enfermedad. [ENG] Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor of the central nervous system in adults. Its high proliferation rate, invasive capacity, molecular heterogeneity, and therapeutic resistance contribute to its prognosis extremely poor prognosis, with an average survival of less than 15 months, even after optimal treatment. Considering this, the search for new therapeutic compounds that offer more effective alternatives is essential. With advances at the molecular level, the growing understanding of GBM’s complexity, the rise of precision medicine, and the development of alternative in vivo models to traditional ones, the development of new compounds is becoming increasingly feasible. Since the 1970s, the zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as an animal model, becoming a promising organism for biomedical research due to its advantageous biological and genetic characteristics, as well as economic and logistical feasibility. Over the past decade, zebrafish have proven to be highly useful as an in vivo model for xenotransplantation assays, particularly for GBM tumors, due to their ability to facilitate studies of tumor, allowing the study of tumor–microenvironment interactions, tumor growth, invasion, and overall GBM pathophysiology. Furthermore, they also allow for the evaluation of compound toxicity and therapeutic efficacy in preclinical trials, enabling the assessment of response to GBM. Based on this rationale, the present study aimed to evaluate the in vivo therapeutic potential of an experimental compound (GBM48) using zebrafish embryos as a xenotransplantation model, while also validating the zebrafish as a preclinical tool. The results obtained strengthen the position of zebrafish as an ideal platform for the rapid and effective screening of innovative therapies against GBM. This model helps bridge the gap between molecular and genetic tumor characterization and its clinical application, offering a promising path toward the development of new personalized treatments for patients affected by this disease. [GLG] O glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor cerebral primario máis frecuente e agresivo do sistema nervioso central en adultos. A súa alta taxa de proliferación, capacidade invasiva, heteroxeneidade molecular e resistencia terapéutica fan que o seu pronóstico sexa extremadamente desfavorable, cunha media de supervivencia inferior aos 15 meses, mesmo tras recibir un tratamento óptimo. Ante esta situación, faise imprescindible a busca de novos compostos terapéuticos que ofrezan alternativas máis eficaces. Cos avances a nivel molecular, a recente ampliación do coñecemento sobre a gran heteroxeneidade do GBM e o desenvolvemento da medicina de precisión, así como a aparición de modelos in vivo alternativos aos tradicionais, fai que cada vez sexa máis fácil o desenvolvemento de novos compostos. A partir da década de 1970 comezou a empregarse de forma estendida o peixe cebra (Danio rerio) como modelo animal, converténdose nun organismo prometedor para a investigación biomédica polas súas vantaxes biolóxicas e xenéticas, así como polas súas facilidades económicas e loxísticas, ideais para a investigación. Durante a última década, o peixe cebra foi de gran utilidade como modelo in vivo para a realización de ensaios de xenotrasplante, concretamente de tumores de GBM, debido a súa utilidade nos experimentos in vivo, permitindo estudar as interaccións do tumor co microambiente, o crecemento tumoral, a invasión e, en xeral, a fisiopatoloxía do GBM. Así mesmo, tamén permite a evaluación de toxicidade e a efectividade de compostos terapéuticos en ensaios preclínicos, avaliando a súa resposta fronte ao GBM. Tendo isto en conta, neste traballo buscouse avaliar in vivo o potencial terapéutico dun composto experimental (GBM48) empregando embrións de peixe cebra como modelo de xenotrasplante, así como validar o peixe cebra como modelo preclínico. Os resultados obtidos reforzan o peixe cebra como unha ferramenta ideal para a análise rápida e eficaz de terapias innovadoras fronte ao GBM, achegando o coñecemento molecular e xenético do tumor á súa aplicación clínica, e converténdoo nunha vía prometedora para o desenvolvemento de novos tratamentos personalizados para pacientes que padezan esta enfermidade.
Análise do contido de Adenosina, Inosina e Acido Úrico de leite consumido en Galicia
(2025) Lage González, Sofía
[SPA] La metabolómica es una disciplina centrada en analizar el metaboloma, es decir el conjunto de metabolitos presentes en una célula, fluido, tejido u organismo. Uno de los campos a los que se aplican los estudios metabolómicos es en la caracterización de alimentos buscando una alimentación segura y saludable, lo que se conoce como Foodomica. Un objetivo principal de la Foodomica es la investigación sobre los compuestos bioactivos, metabolitos que se encuentran en cantidades pequeñas en los alimentos y que pueden modular uno o más procesos metabólicos resultando beneficiosos para la salud. El objetivo de este trabajo fin de grado (TFG) consiste en caracterizar la leche consumida en Galicia, un alimento fundamental en nuestra dieta, en cuanto a su contenido en 3 metabolitos bioactivos: los nucleósidos adenosina e inosina y la base nitrogenada ácido úrico utilizando un equipo de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) empleando un método puesto a punto en un TFG previo. Para llevar a cabo el análisis, se recogieron muestras de leche en diferentes etapas (leche cruda, termizada, de silo y UHT) en una industria láctea gallega (LARSA) y se aplicaron técnicas de desproteinización, centrifugación y filtración permitiendo identificar los compuestos mediante tiempos de retención, espectros de absorción, sobrecargas de patrones y liofilización. Los resultados mostraron que el trabajo permitió validar el método puesto a punto para el análisis de estos metabolitos bioactivos en leche y el método aplicado no modificaba las concentraciones de los tres metabolitos en las distintas etapas de procesado a las que se sometieron las leches. En conclusión, el trabajo demostró la gran importancia de la aplicación del HPLC para la investigación en nutrición y calidad alimentaria. [ENG] Metabolomics is a discipline focused on analysing the metabolome, i.e. the set of metabolites present in a cell, fluid, tissue or organism. One of the fields to which metabolomic studies are applied is the characterisation of foods in pursuit of safe and healthy nutrition, known as Foodomics. A main objective of Foodomics is research into bioactive compounds, metabolites found in small quantities in food that can modulate one or more metabolic processes, resulting in health benefits. The aim of this final degree project (TFG) is to characterise the milk consumed in Galicia, a staple food in our diet, in terms of its content of three bioactive metabolites: the nucleosides adenosine and inosine and the nitrogenous base uric acid, using high performance liquid chromatography (HPLC) equipment and a method developed in a previous TFG. To carry out the analysis, milk samples were collected at different stages (raw milk, thermised milk, silo milk and UHT milk) at a Galician dairy (LARSA) and deproteinisation, centrifugation and filtration techniques were applied to identify the compounds using retention times, absorption spectra, pattern overloads and freeze drying. The results showed that the work validated the method developed for the analysis of these bioactive metabolites in milk and that the method applied did not alter the concentrations of the three metabolites at the different stages of processing to which the milk was subjected. In conclusion, the work demonstrated the great importance of applying HPLC to research in nutrition and food quality. [GLG] A metabolómica é unha disciplina centrada en analizar o metaboloma, é dicir o conxunto de metabolitos presentes nunha célula, fluído, tecido ou organismo. Un dos campos aos que se aplican os estudos metabolómicos é na caracterización de alimentos buscando unha alimentación segura e saudable, o que se coñece como Foodomica. Un obxectivo principal da Foodomica é a investigación sobre os compostos bioactivos, metabolitos que se atopan en cantidades pequenas nos alimentos e que poden modular un ou máis procesos metabólicos resultando beneficiosos para a saúde. O obxetivo de leste traballo fin de grao (TFG) consiste en caracterizar o leite consumido en Galicia, un alimento fundamental na nosa dieta, en canto ao seu contido en 3 metabolitos bioactivos: os nucleósidos adenosina e inosina e a base nitroxenada ácido úrico utilizando un equipo de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) empregando un método posto a punto nun TFG previo. Para levar a cabo a análise, recolléronse mostras de leite en diferentes etapas (leite cruda, termizada, de silo e UHT) nunha industria láctea galega (LARSA) e aplicáronse técnicas de desproteinización, centrifugación e filtración permitindo identificar os compostos mediante tempos de retención, espectros de absorción, sobrecargas de patróns e liofilización. Os resultados mostraron que o traballo permitiu validar o método posto a punto para a análise destes metabolitos bioactivos en leite e o método aplicado non modificaba as concentracións dos tres metabolitos nas distintas etapas de procesado ás que se someteron os leites. En conclusión, o traballo demostrou a gran importancia da aplicación do HPLC para a investigación en nutrición e calidade alimentaria.
Avaliación dos efectos dos pesticidas en dúas liñas celulares
(2025) Jiménez Gancedo, Meilí
[SPA] El aumento del uso de pesticidas para maximizar el rendimiento agrícola ha generado una creciente preocupación a nivel mundial debido los efectos adversos de estos compuestos sobre el medio ambiente y la salud humana. Además de afectar a las especies diana, los pesticidas pueden perjudicar a otros organismos, generar desequilibrios ecológicos y bioacumularse en los tejidos, lo que incrementa su toxicidad a lo largo de la cadena trófica. En humanos, la exposición a estos compuestos puede provocar desde síntomas leves hasta efectos graves e incluso letales, tanto en exposiciones agudas como crónicas. En este Trabajo de Fin de Grado se evaluaron los efectos citotóxicos de tres pesticidas ampliamente empleados (metolacloro, metazacloro y clorpirifós) en dos líneas celulares: Neuro-2a (neuroblastoma murino) y HEK293 Nav1.6 (derivada de riñón embrionario humano). Se analizaron distintas concentraciones de cada compuesto mediante los ensayos MTT (tras 72 horas de exposición) y Alamar Blue (a las 24, 48 y 72 horas de exposición). Los resultados mostraron que ninguno de los pesticidas, a las concentraciones evaluadas, produjo una disminución significativa en la viabilidad celular. No obstante, no se pueden descartar posibles efectos citotóxicos a concentraciones más elevadas ni otros tipos de alteraciones celulares, por lo que se consideran necesarias investigaciones adicionales que permitan ampliar la evaluación del riesgo asociado a la exposición a estos compuestos. [GLG] O uso crecente de pesticidas para maximizar o rendemento agrícola xerou unha preocupación cada vez maior a nivel mundial debido aos efectos adversos destes compostos sobre o medio ambiente e a saúde humana. Ademais de afectar ás especies diana, os pesticidas poden prexudicar a outros organismos, xerar desequilibrios ecolóxicos e bioacumularse nos tecidos, o que incrementa a súa toxicidade ao longo da cadea trófica. En humanos, a exposición a estes compostos pode provocar dende síntomas leves ata efectos graves e mesmo letais, tanto en exposicións agudas como crónicas. Neste traballo de fin de grao avaliáronse os efectos citotóxicos de tres pesticidas amplamente empregados (metolacloro, metazacloro e clorpirifós) en dúas liñas celulares: Neuro-2a (neuroblastoma murino) e HEK293 Nav1.6 (derivada de ril embrionario humano). Analizáronse distintas concentracións de cada composto mediante os ensaios MTT (despois de 72 horas de exposición) e Alamar Blue (ás 24, 48 e 72 horas de exposición). Os resultados mostraron que ningún dos pesticidas, nas concentracións avaliadas, produciu unha diminución significativa na viabilidade celular. Porén, non se poden descartar posibles efectos citotóxicos a concentracións máis elevadas nin outros tipos de alteracións celulares, polo que se consideran necesarias investigacións adicionais que permitan ampliar a avaliación do risco asociado á exposición a estes compostos. [ENG] The increasing use of pesticides to maximize agricultural yield has generated growing concern worldwide due to the adverse effects of these compounds on both the environment and human health. In addition to affecting target species, pesticides can harm other organisms, disrupt the ecological balance, and bioaccumulate in tissues, thereby increasing their toxicity throughout the food chain. In humans, exposure to these compounds can lead to a wide range of effects, from mild symptoms to severe and even lethal outcomes, in both acute and chronic exposures. In this Final Degree Project, the cytotoxic effects of three widely used pesticides (metolachlor, metazachlor, and chlorpyrifos) were evaluated on two cell lines: Neuro-2a (murine neuroblastoma) and HEK293 Nav1.6 (derived from human embryonic kidney). Different concentrations of each compound were analysed using MTT assay (after 72 hours of exposure) and Alamar Blue assay (at 24, 48, and 72 hours of exposure). The results showed that none of the pesticides, at the concentrations tested, caused a significant decrease in cell viability. However, potential cytotoxic effects at higher concentrations, as well as other cellular alterations, cannot be ruled out. Therefore, further research is needed to expand the risk assessment associated with exposure to these compounds.
Detección rápida de biofilms de Listeria monocytogenes en superficies mediante amplificación isotérmica de ADN
(2025) Garrido Pérez, Carmen Pilar
[SPA] Listeria monocytogenes es un patógeno de transmisión alimentaria de alta relevancia a nivel global por su elevada tasa de mortalidad. Su gran capacidad de adaptación a condiciones ambientales adversas y su capacidad para formar biofilms aumentan su resistencia y dificultan su eliminación. Las técnicas de diagnóstico tradicionales, basadas en el cultivo bacteriano, requieren de varios días para determinar la muestra como positiva. Para solventar estos problemas, en los últimos años se han desarrollado técnicas moleculares más rápidas y sensibles como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y el LAMP (amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle). En este trabajo se desarrolló un método rápido de detección de biofilms de L. monocytogenes en superficies de acero inoxidable mediante LAMP. Para ello se evaluó la recuperación de células de los biofilms con distintos tratamientos (PBS, LPT y LPT-PRN), el impacto del enriquecimiento de las muestras en TSB durante 3 horas y la purificación del ADN previo a la amplificación. Los resultados demostraron que el método LAMP, tanto en su formato a tiempo real como colorimétrico, permite detectar L. monocytogenes en biofilms monoespecie y mixtos a concentraciones superiores a 3,9 log UFC/cm2, con mejoras notables tras un enriquecimiento de 3 horas y la purificación del ADN de las muestras. Este formato colorimétrico puede llevarse a cabo utilizando únicamente un termobloque, sin necesidad de equipos especializados, lo que lo convierte en una herramienta accesible, rápida y robusta para su aplicación en entornos industriales.
Novos catalizadores biomiméticos de manganeso: estudo da súa actividade antioxidante.
(2025) Gándara Lafuente, Ana
[GLG] O manganeso é un metal esencial que participa en numerosos procesos biolóxicos. Está presente no centro activo ou actúa como cofactor de antioxidantes naturais. Por iso, o uso de complexos de manganeso presenta unha potencial aplicación como un modelo biomimético destes encimas antioxidantes. A función destes encimas é neutralizar ás especies reactivas de osíxeno, fortes oxidantes que causan o estrés oxidativo, para manter o equilibrio biolóxico e evitar danos celulares. Estes antioxidantes sintéticos presentan vantaxes fronte aos naturais debido ás súas características, como o baixo peso molecular, e ao reducido coste de produción, polo que supoñen unha alternativa ao seu uso en terapias. Neste proxecto, sintetizouse un complexo metálico de manganeso a partir dun ligando base de Schiff obtido mediante a condensación de 1,2-diaminopropano e 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehido. A súa caracterización levouse a cabo mediante estudos de condutividade, espectroscopia IR, espectroscopia Ultravioleta- Visible, cristalografía de raios X e espectrometría de masas entre outras técnicas. Realizouse un estudo do seu potencial redox mediante ensaios de voltametría cíclica. A súa actividade catalítica como antioxidante avaliouse mediante ensaios de peroxidase, catalase e catecol oxidase. Os estudos demostran a correcta obtención do complexo, unha elevada reversibilidade do proceso Mn(II)/Mn(III) e indican unha actividade catalítica alta o que confirma o papel mimético antioxidante. [SPA] El manganeso es un metal esencial que participa en numerosos procesos biológicos. Está presente en el centro activo o actúa como cofactor de antioxidantes naturales. Por ello, el uso de complejos de manganeso presenta una potencial aplicación como un modelo biomimético de estas encimas antioxidantes. La función de estas enzimas es neutralizar a las especies reactivas de oxígeno, fuertes oxidantes que causan el estrés oxidativo, para mantener el equilibrio biológico y evitar daños celulares. Estos antioxidantes sintéticos presentan ventajas frente a los naturales debido a sus características, como su bajo peso molecular, y a su reducido coste de producción, por lo que suponen una alternativa a su uso en terapias. En este proyecto, se sintetizó un complejo metálico de manganeso a partir de un ligando base de Schiff obtenido mediante la condensación de 1,2-diaminopropano e 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehido. Su caracterización se llevó a cabo mediante estudios de conductividad, espectroscopía IR, espectroscopía Ultravioleta- Visible, cristalografía de rayos X y espectrometría de masas entre otras técnicas. Se realizó un estudio de su potencial redox mediante ensayos de voltametría cíclica. Su actividad catalítica como antioxidante se evaluó mediante ensayos de peroxidasa, catalasa y catecol oxidasa. Los estudios demuestran la correcta obtención del complejo, una elevada reversibilidad del proceso Mn(II)/Mn(III) e indican una actividad catalítica alta, lo que confirma su papel mimético antioxidante. [ENG] Manganese is an esencial metal which participates in numerous biological processes. It is part of the active site or acts as a cofactor of natural antioxidants. Hence, the application of manganese complexes shows potencial as an antioxidant enzyme biomimetic model. The role of these enzymes is to neutralize reactive oxygen species, which are strong oxidants that cause oxidative stress, in order to maintain biological balance and avoid cellular damage. These synthetic antioxidants have advantages comparing them to natural antioxidants because of their characteristics, such as their low molecular weight and their low productioncosts. Therefore, they are an alternative to natural antioxidants therapy. In this project, we synthesized a metal manganese complex using a base Schiff ligand obtained by condensation of 1,2-diaminopropane and 2-hydroxy-3-metoxybenzaldehyde. The complex was characterized by conductivity studies, IR and ultraviolet – visible espectroscopies, X ray cristallography and mass spectrometry among other analysis. Its redox potencial was tested by cyclic voltammetry. Its catalytic antioxidant activity was determined by peroxidase, catalase and catechol oxidase essays. The studies demonstrate the correct obtention of the manganosalen complex, a high rate of reversibility for the Mn(II)/Mn(III) process and relevant catalytic activities, which confirm its antioxidant mimetic role.
Deleción de genes del resistoma secundario de Escherichia coli de origen animal y/o humana resistente a cefotaxima
(2025-06) Farto Pastoriza, Natalia; Universidade de Santiago de Compostela. Facultade de Ciencias
[SPA] La rápida diseminación de la resistencia a los antimicrobianos a nivel mundial constituye una de las principales amenazas para la salud pública actual. La escasez de tratamientos eficaces frente a infecciones causadas por bacterias multirresistentes (MDR) subraya la necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y profilácticas. En este contexto, la OMS ha clasificado a las Enterobacterias resistentes a cefalosporinas de tercera generación como “prioridad crítica”, debido a su potencial para causar infecciones graves y a la limitación de terapias efectivas para combatirlas. Este estudio investiga el papel del gen mnmA, perteneciente al resistoma secundario (RS) de Escherichia coli, frente a la cefotaxima (CTX), en cepas clínicas de E.coli resistentes a dicho antibiótico, dado que las proteínas codificadas por genes de RS podrían representar dianas para fármacos adyuvantes. Mediante mutagénesis dirigida, se delecionó el gen mnmA sustituyéndolo por una casete de resistencia a Kan codificada en el plásmido pKD4. En las colonias mutantes obtenidas se determinó el perfil de resistencia a CTX mediante el análisis de la concentración mínima inhibitoria (MIC) y se compararon con los valores obtenidos en las cepas silvestres correspondientes. Adicionalmente, se evaluó si la deleción del gen mnmA afectaba el crecimiento de las cepas en presencia de CTX —concentración aproximada de 1/2 de la MIC determinada para la cepa silvestre— y, por tanto, su susceptibilidad al antibiótico, mediante un ensayo “TimeKill Assay”. Los resultados evidenciaron que mnmA forma parte del RS de E.coli frente a CTX, ya que su deleción aumenta la susceptibilidad bacteriana al antibiótico observando una disminución de la MIC de CTX en las cepas mutantes (entre 4-8 veces) respecto a las cepas silvestres correspondientes. Además, el ensayo “Time-Kill Assay” en presencia de CTX mostró una reducción gradual de las UFC/mL a lo largo del tiempo en las cepas mutantes en comparación con las cepas silvestres. [GLG] A rápida diseminación da resistencia aos antimicrobianos a nivel mundial constitúe unha das principais ameazas para a saúde pública actual. A escaseza de tratamentos eficaces fronte a infeccións causadas por bacterias multirresistentes (MDR) subliña a necesidade de desenvolver novas estratexias terapéuticas e profilácticas. Neste contexto, a OMS clasificou ás Enterobacterias resistentes a cefalosporinas de terceira xeración como "prioridade crítica", debido ao seu potencial para causar infeccións graves e á limitación de terapias efectivas para combatelas. Este estudo investiga o papel do xene mnmA, pertencente ao resistoma secundario (RS) de Escherichia coli, fronte á cefotaxima (CTX), en cepas clínicas de E.coli resistentes ao dito antibiótico, dado que as proteínas codificadas por xenes do RS poderían representar dianas para fármacos adxuvantes. Mediante mutaxénese dirixida, delecionouse o xene mnmA substituíndoo por unha casete de resistencia a Kan codificada no plásmido pKD4. Nas colonias mutantes obtidas determinouse o perfil de resistencia a CTX mediante a análise da concentración mínima inhibitoria (MIC) e comparáronse cos valores obtidos nas cepas silvestres correspondentes. Adicionalmente, avaliouse se a deleción do xene mnmA afectaba ao crecemento das cepas en presenza de CTX concentración aproximada de 1/2 da MIC determinada para a cepa silvestre— e, por tanto, a súa susceptibilidade ao antibiótico, mediante un ensaio "Time-Kill Assay". Os resultados evidenciaron que mnmA forma parte do RS de E.coli fronte a CTX, xa que a súa deleción aumenta a susceptibilidade bacteriana ao antibiótico observando unha diminución da MIC de CTX nas cepas mutantes (entre 4-8 veces) respecto ás cepas silvestres correspondentes. Ademais, o ensaio "Time-Kill Assay" en presenza de CTX mostrou unha redución gradual das UFC/mL ao longo do tempo nas cepas mutantes en comparación coas cepas silvestres. [ENG] The rapid global spread of antimicrobial resistance is one of the main threats to current public health. The scarcity of effective treatments for infections caused by multidrug-resistant bacteria (MDR) underscores the urgent need to develop new therapeutic and prophylactic strategies. In this context, the WHO has classified third-generation cephalosporin-resistant Enterobacteriaceae as a "critical priority", due to their potential to cause serious infections and the limited effective therapies available to combat them. This study investigates the role of the mnmA gene, belonging to the secondary resistome (RS) of Escherichia coli, against cefotaxime (CTX) in clinical E.coli strains resistant to this antibiotic, since the proteins encoded by RS genes could represent targets for adjuvant drugs. Using sitedirected mutagenesis, the mnmA gene was deleted and replaced by a Kan resistance cassette encoded on the pKD4 plasmid. The CTX resistance profile of the obtained mutant colonies was determined by the analysis of the minimum inhibitory concentration (MIC) and compared with the values obtained in the corresponding wild-type strains. Additionally, we evaluated whether mnmA gene deletion affected the growth of the strains in the presence of CTX —at approximately 1/2 the wild-type strain’s determined MIC— and, therefore, their susceptibility to the antibiotic, using a "Time-Kill Assay". The results showed that mnmA is part of the RS of E.coli against CTX, asits deletion increases bacterial susceptibility to the antibiotic observing a decrease in CTX MIC in mutant strains (4-8- fold) compared to their corresponding wild-type strains. In addition, the "Time-Kill Assay" in the presence of CTX showed a gradual reduction in CFU/mL over time in the mutant strains compared to wild-type strains.
Aplicación de métodos de proteómica baseados en espectrometría de masas para o estudo de proteínas de orixe lácteo
(2025) Gallego Santomé, Ana Yi
[SPA] La leche y sus derivados son una fuente esencial de proteínas en la dieta humana, especialmente de caseínas, que representan aproximadamente el 80 % del contenido proteico total. Estas proteínas no solo desempeñan funciones nutricionales, sino que también influyen en la textura, estabilidad y valor tecnológico de los productos lácteos. Debido a su importancia, es necesario contar con métodos analíticos que permitan identificarlas y cuantificarlas de forma precisa y específica en distintas matrices alimentarias. Durante este trabajo se busca el desarrollo de un método de análisis basado en espectrometría de masas en modo MRM (Multiple Reaction Monitoring) acoplado a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-MS/MS), con el objetivo de identificar y cuantificar de manera simultánea cuatro tipos principales de caseínas (α1, α2, β y κ) en productos de origen lácteo. Para ello, se ha seguido un enfoque de proteómica bottom-up, que consiste en la digestión enzimática de las proteínas presentes en la muestra antes de su análisis. Además, se ha empleado el método AQUA (Absolute Quantification), que permite una cuantificación absoluta gracias al uso de péptidos sintéticos marcados isotópicamente que se comportan de manera idéntica a sus homólogos endógenos. Tras la optimización de las condiciones cromatográficas y espectrométricas, el método se aplicó a cinco matrices lácteas: leche, batido, yogur, helado y queso tanto en su estado de materia prima como de producto final. Los resultados revelaron variaciones en la concentración de las diferentes caseínas atribuibles al procesamiento industrial. Este estudio demuestra la utilidad de aplicar técnicas de proteómica para el análisis de proteínas lácteas. [GLG] O leite e os seus derivados son unha fonte esencial de proteínas na dieta humana, especialmente das caseínas, que representan aproximadamente o 80 % do contido proteico total. Estas proteínas non só cumpren funcións nutricionais, senón que tamén inflúen na textura, estabilidade e valor tecnolóxico dos produtos lácteos. Debido a súa importancia, é necesario dispoñer de métodos analíticos que permitan identificalas e cuantificalas de forma precisa e específica en distintas matrices alimentarias. Durante este traballo búscase o desenvolvemento dun método de análise baseado na espectrometría de masas en modo MRM (Multiple Reaction Monitoring) acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-MS/MS), co obxectivo de identificar e cuantificar simultaneamente catro tipos principais de caseínas (α1, α2, β e κ) en produtos de orixe láctea. Para iso, seguiuse un enfoque de proteómica bottom-up, que consiste na dixestión enzimática das proteínas presentes na mostra antes do seu análise. Ademais, empregouse o método AQUA (Absolute Quantification), que permite unha cuantificación absoluta grazas ao uso de péptidos sintéticos marcados isotopicamente que se comportan de maneira idéntica aos seus homólogos endóxenos. Unha vez optimizadas as condicións cromatográficas e espectrométricas, o método aplicouse a cinco matrices lácteas: leite, batido, iogur, xeado e queixo, tanto en estado de materia prima como de produto final. Os resultados amosaron variacións nas concentracións das diferentes caseínas atribuíbles ao procesado industrial. Este estudo demostra a utilidade de empregar técnicas de proteómica no estudo das proteínas lácteas. [ENG] Milk and its derivatives are an essential source of protein in the human diet, especially caseins, which represent approximately 80% of the total protein content. These proteins not only perform nutritional functions but also influence the texture, stability, and technological value of dairy products. Due to their importance, analytical methods are needed to accurately and specifically identify and quantify them in different food matrices. This study seeks to develop an analytical method based on mass spectrometry in MRM (Multiple Reaction Monitoring) mode coupled with high-performance liquid chromatography (HPLC-MS/MS), with the aim of simultaneously identifying and quantifying four main types of caseins (α1, α2, β, and κ) in dairy products. To this end, a bottom-up proteomics approach was followed, which consists of the enzymatic digestion of the proteins present in the sample before analysis. Furthermore, the AQUA (Absolute Quantification) method was used, which allows absolute quantification thanks to the use of isotopically labeled synthetic peptides that behave identically to their endogenous counterparts. After optimizing the chromatographic and spectrometric conditions, the method was applied to five dairy matrices: milk, milkshake, yogurt, ice cream, and cheese, both as raw materials and as final products. The results revealed variations in the concentration of the different caseins attributable to industrial processing. This study demonstrates the usefulness of applying proteomic techniques for the analysis of dairy proteins.
Caracterización fenotípica de una línea de pez cebra mutante para el gen rft1
(2025-06) Correal Pérez, Iria; Universidade de Santiago de Compostela. Facultade de Ciencias
[SPA] La glicosilación es una modificación postraduccional, de la cual existen varios tipos, que tiene lugar en diferentes compartimentos celulares. Cualquier alteración en genes, como por ejemplo RFT1, implicados en esta ruta causa los llamados trastornos congénitos de la glicosilación (CDG). El gen RFT1 podría codificar para un transportador que participa en la vía de N-glicosilación. En el presente trabajo, se utilizó el pez cebra como modelo experimental para esclarecer algunos de los efectos de la mutación en este gen. El objetivo de la investigación fue determinar la repercusión que tenía la mutación en la supervivencia y en la regeneración tisular. Para alcanzar los objetivos, se llevaron a cabo genotipados, cortes de aleta y varios análisis estadísticos. Los resultado obtenidos mostraron que los individuos homocigotos para la mutación contaban con una menor tasa de supervivencia, así como una regeneración de la aleta caudal significativamente inferior en comparación con los individuos heterocigotos y de tipo salvaje. Además, estos síntomas se correlacionaban con los descritos en pacientes que padecían un CDG. Con todo esto, se concluyó que la mutación en el gen rft1 afectaba al desarrollo larval del pez cebra, así como impedía la correcta regeneración tisular, en este caso, de la aleta caudal. [GLG] A glicosilación é unha modificación postraduccional, da cal existen varios tipos, que teñen lugar en diferentes compartimentos celulares. Calquera alteración en xenes, como por exemplo RFT1, implicados nesta ruta causa os chamados trastornos conxénitos da glicosilación (CDG). O xene RFT1 podería codificar para un transportador que participa na vía de N-glicosilación. No presente traballo, utilizouse o peixe cebra como modelo experimental para esclarecer algúns dos efectos da mutación neste xene. O obxectivo de investigación foi determinar a repercusión que tiña a mutación na supervivencia e na rexeneración tisular. Para acadar os obxectivos, leváronse a cabo xenotipados, cortes de aleta e varias análises estatísticas. Os resultado obtidos mostraron que os individuos homocigotos para a mutación contaban cunha menor taxa de supervivencia, así como unha rexeneración da aleta caudal significativamente inferior en comparación cos individuos heterocigotos e de tipo salvaxe. Ademais, estes síntomas correlacionábanse cos descritos en pacientes que padecían un CDG. Con todo isto, concluíuse que a mutación no xene rft1 afectaba o desenvolvemento larval do peixe cebra, así como impedía a correcta rexeneración tisular, neste caso, da aleta caudal. [ENG] Glycosylation is a post-translational modification, of which there are several types, taking place in different cell compartments. Any alteration in genes, such as RFT1, involved in this pathway causes so-called congenital glycosylation disorders (CDG). The RFT1 gene could encode for a transporter that participates in the N-glycosylation pathway. In the present work, zebrafish was used as an experimental model to elucidate some of the effects of mutation on this gene. The aim of the research was to determine the impact of the mutation on survival and tissue regeneration. To achieve the objectives, genotyping, fin cutting and various statistical analyses were carried out. The results obtained showed that homozygous individuals for the mutation had a lower survival rate, as well as a significantly lower caudal fin regeneration compared to heterozygote and wild-type individuals. In addition, these symptoms were correlated with those described in patients with CDG. With all this, it was concluded that the mutation in gene rft1 affected the larval development of zebrafish, as well as preventing the correct tissue regeneration, in this case, the caudal fin.
Estudo dos reguladores de m6A en ARN en envellecemento acelerado e no rexuvenecemento mediante reprogramación somática celular
(2025) Constenla Quinteiro, Ana
[GLG] Este traballo de fin de grao céntrase no estudo dos reguladores epitranscritómicos da modificación N6-metiladenosina (m⁶A) no ARN, un mecanismo clave no control post-transcricional da expresión xénica. A investigación aborda dúas situacións biolóxicas contrapostas: o envellecemento acelerado, a través do modelo da síndrome de proxeria de Hutchinson-Gilford (HGPS), e o rexuvenecemento celular, mediante reprogramación somática a células nai pluripotentes inducidas (iPSCs). Na primeira parte do estudo, realizouse unha análise bioinformática dun conxunto de datos transcriptómicos de fibroblastos de rato homocigotos para a expresión de proxerina. Mediante ferramentas como BioJupies e Morpheus, examinouse a expresión dos xenes Mettl3, Mettl14, Mettl16, Fto e Alkbh5. Non se observaron cambios significativos entre as condicións proxéricas e control, indicando que a regulación funcional destas encimas podería non depender exclusivamente da súa expresión transcricional. Na segunda parte, levouse a cabo un estudo in silico da expresión dos reguladores de m6A empregando datos de secuenciación masiva publicados de reprogramación celular somática, así como un modelo experimental de reprogramación celular somática infectando fibroblastos de rato cun vector lentiviral que expresa os factores de Yamanaka (OKSM). Observouse que os niveis de expresión de Mettl3 e Mettl14 aumentan progresivamente durante o proceso. Ademáis, mediante a interferencia de Mettl3 con shARN, observouse unha diminución na eficiencia da reprogramación, evidenciada pola redución de células positivas para Nanog. En conxunto, os resultados indican que os reguladores da m⁶A non están transcricionalmente alterados en proxeria, pero parecen xogar un papel no establecemento do estado pluripotente. Estes achados sitúan a metilación de ARN como un factor clave no control da identidade celular e na determinación da idade celular, abrindo novas posibilidades para investigacións en terapias anti-envellecemento e rexenerativas. [SPA] Este trabajo de fin de grado se centra en el estudio de los reguladores epitranscriptómicos de la modificación N6-metiladenosina (m⁶A) en el ARN, un mecanismo clave en el control post-transcripcional de la expresión génica. La investigación aborda dos situaciones biológicas contrapuestas: el envejecimiento acelerado, a través del modelo del síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS), y el rejuvenecimiento celular, mediante la reprogramación somática a células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). En la primera parte del estudio se analizó un conjunto de datos transcriptómicos de fibroblastos de ratón homocigotos para la expresión de progerina, utilizando herramientas bioinformáticas como BioJupies y Morpheus. No se observaron cambios significativos en la expresión de Mettl3, Mettl14, Mettl16, Fto y Alkbh5 entre las condiciones control y HGPS, sugiriendo que su regulación funcional podría no depender de su expresión transcripcional. En la segunda parte, se llevó a cabo un estudio in silico de la expresión de los reguladores de m6A utilizando datos de secuenciación masiva publicados sobre la reprogramación celular somática, así como un modelo experimental de reprogramación celular somática mediante la infección de fibroblastos de ratón con un vector lentiviral que expresa los factores de Yamanaka (OKSM). Se observó que los niveles de expresión de Mettl3 y Mettl14 aumentan progresivamente durante el proceso. Además, mediante la interferencia de Mettl3 con shARN, se observó una disminución en la eficiencia de la reprogramación, evidenciada por la reducción de células positivas para Nanog. En conjunto, los resultados indican que los reguladores de m⁶A no están alterados transcripcionalmente en la progeria, pero parecen desempeñar un papel en el establecimiento del estado pluripotente. Estos hallazgos sitúan a la metilación del ARN como un factor clave en el control de la identidad celular y en la determinación de la edad celular, abriendo nuevas posibilidades para investigaciones en terapias antienvejecimiento y regenerativas. [ENG] This undergraduate thesis focuses on the study of epitranscriptomic regulators of the N6-methyladenosine (m⁶A) modification in RNA, a key mechanism in the post-transcriptional control of gene expression. The research addresses two opposing biological scenarios: accelerated aging, using the Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) model, and cellular rejuvenation, through somatic reprogramming into induced pluripotent stem cells (iPSCs). In the first part of the study, a transcriptomic dataset from mouse fibroblasts homozygous for progerin expression was analyzed using bioinformatic tools such as BioJupies and Morpheus. The expression levels of Mettl3, Mettl14, Mettl16, Fto, and Alkbh5 showed no significant differences between HGPS and control samples. This suggests that the functional regulation of these enzymes may not rely solely on transcriptional expression. In the second part, an in silico study of the expression of m6A regulators was conducted using publicly available high-throughput sequencing data from somatic cell reprogramming, as well as an experimental model of somatic cell reprogramming by infecting mouse fibroblasts with a lentiviral vector expressing the Yamanaka factors (OKSM). It was observed that the expression levels of Mettl3 and Mettl14 progressively increase during the process. Furthermore, knockdown of Mettl3 using shRNA resulted in reduced reprogramming efficiency, as evidenced by a decrease in Nanog-positive cells. Altogether, the results indicate that m⁶A regulators are not transcriptionally altered in progeria, but they appear to play a role in establishing the pluripotent state. These findings position RNA methylation as a key factor in the control of cell identity and in the regulation of cellular aging, opening new avenues for research into anti-aging and regenerative therapies.
Caracterización de plásmidos de cepas de Escherichia coli patóxenos extraintestinais (ExPEC) multirresistentes aos antibióticos de orixe humana.
(2025) Capón Saa, Marta
[SPA] El aumento progresivo de las resistencias adquiridas a antibióticos en bacterias patógenas está favoreciendo la aparición de clones multirresistentes (MDR), lo que representa una amenaza significativa para la medicina moderna. Una de las principales vías de transmisión de genes de resistencia y virulencia es la adquisición de plásmidos mediante el proceso de conjugación. Estudiar los mecanismos que intervienen en la transferencia y estabilización de estos plásmidos epidémicos se plantea como una línea estratégica clave para frenar la propagación de la multirresistencia. En este contexto, analizamos una colección de ocho cepas productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) pertenecientes al clon ST131 de E. coli—identificado como uno de los principales vectores de la diseminación mundial de BLEE—, aisladas de infecciones extraintestinales. A través de experimentos de conjugación in vitro y mediante la caracterización molecular y fenotípica de las cepas y sus transconjugantes. Tras una primera caracterización, se seleccionaron siete de las ocho cepas como donadoras para los ensayos de conjugación. De estas, solo una fue capaz de transferir plásmidos conjugativos bajo las condiciones evaluadas, con frecuencias de conjugación muy bajas. La caracterización molecular y fenotípica de la cepa transconjugante permitió confirmar el papel de un plásmido IncF —multirreplicón (IncFII/IncFIB) con una relaxasa del tipo MOBF12— en la fisiología de las cepas receptoras AAG1 y MG1655. Se corroboró su implicación en la transferencia de genes de virulencia asociados al patotipo UPEC. Adicionalmente, confirmamos el papel de la transferencia horizontal de genes (HGT) en la adquisición de genes de resistencia a betalactámicos. También se evaluó el efecto de este plásmido sobre la motilidad y la capacidad de producción de hemolisina de las cepas receptoras, constatando que su adquisición no alteraba estos aspectos fisiológicos. En conclusión, este estudio logró la transferencia horizontal de un plásmido IncF, validando los análisis genotípicos previos y permitiendo evaluar su impacto en la fisiología bacteriana. Aunque se requieren investigaciones futuras para optimizar los protocolos de conjugación y favorecer la expresión de estos mecanismos en cepas ST131. [GLG] O aumento progresivo das resistencias adquiridas a antibióticos en bacterias patóxenas está favorecendo a aparición de clons multirresistentes (MDR), o que representa unha ameaza significativa para a medicina moderna. Unha das principais vías de transmisión de xenes de resistencia e virulencia é a adquisición de plásmidos mediante o proceso de conxugación. Estudar os mecanismos que interveñen na transferencia e estabilización destes plásmidos epidémicos exponse como unha liña estratéxica clave para frear a propagación da multirresistencia. Neste contexto, analizamos unha colección de oito cepas produtoras de β-lactamasas de espectro estendido (BLEE) pertencentes ao clon ST131 de E. coli—identificado como un dos principais vectores da diseminación mundial de BLEE—, illadas de infeccións extraintestinais. A través de experimentos de conxugación in vitro e mediante a caracterización molecular e fenotípica das cepas e os seus transconxugantes. Tras unha primeira caracterización, seleccionáronse sete das oito cepas como doadoras para os ensaios de conxugación. Destas, só unha foi capaz de transferir plásmidos conxugativos baixo as condicións avaliadas, con frecuencias de conxugación moi baixas. A caracterización molecular e fenotípica das cepas transconxugantes permitiu confirmar o papel dun plásmido IncF—multirreplicón (IncFII/IncFIB) cunha relaxasa do tipo MOBF12—na fisioloxía das cepas receptoras AAG1 y MG1655. Corroborouse a súa implicación na transferencia de xenes de virulencia asociados ao patotipo UPEC. Adicionalmente, confirmamos o papel da transferencia horizontal de xenes (HGT) na adquisición de xenes de resistencia a betalactámicos. Tamén avaliouse o efecto deste plásmido sobre a motilidade e a capacidade de produción de hemolisina das cepas receptoras, constatando que a súa adquisición non alteraba estes aspectos fisiolóxicos. En conclusión, este estudo logrou a transferencia horizontal dun plásmido IncF, validando os análises xenotípicos previos e permitindo avaliar o seu impacto na fisioloxía bacteriana. Aínda que se requiren investigacións futuras para optimizar os protocolos de conxugación e favorecer a expresión destes mecanismos en cepas ST131. [ENG] The progressive increase in acquired antibiotic resistance in pathogenic bacteria is promoting the emergence of multidrug-resistant (MDR) clones, which poses a significant threat to modern medicine. One of the main pathways for the transmission of resistance and virulence genes is the acquisition of plasmids through the process of conjugation. Studying the mechanisms involved in the transfer and stabilization of these epidemic plasmids represents a key strategic line to curb the spread of multidrug resistance. In this context, we analyzed a collection of eight extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing strains belonging to the E. coli ST131 clone—identified as one of the main global vectors of ESBL dissemination—isolated from extraintestinal infections. We conducted in vitro conjugation experiments and performed molecular and phenotypic characterization of both donor strains and their transconjugants. Following an initial characterization, seven of the eight strains were selected as donors for the conjugation assays. Of these, only one was able to transfer conjugative plasmids under the tested conditions, and the conjugation frequencies were very low. The molecular and phenotypic characterization of the resulting transconjugant strain confirmed the role of an IncF multireplicon plasmid (IncFII/IncFIB), carrying a MOBF12-type relaxase, in the physiology of the recipient strains AAG1 and MG1655. Its involvement in the transfer of virulence genes associated with the UPEC pathotype was also confirmed. Additionally, we verified the role of horizontal gene transfer (HGT) in the acquisition of beta-lactam resistance genes. The effect of this plasmid on motility and hemolysin production in the recipient strains was also evaluated, showing that its acquisition did not alter these physiological traits. In conclusion, this study successfully achieved the horizontal transfer of an IncF plasmid, validating previous genotypic analyses and enabling the evaluation of its impact on bacterial physiology. Further research is needed to optimize conjugation protocols and promote the expression of these mechanisms in ST131 strains.
Seguridad alimentaria: Carne de caza como transmisora potencial de clones de enterobacteriaceae de alto riesgo
(2025) Barreiro Álvarez, Carmen Daofang
[SPA] La carne de caza silvestre, como la del jabalí (Sus scrofa), presenta riesgos microbiológicos no equiparables a la carne de animales de granja, debido a la ausencia de controles sanitarios sistemáticos y a diferencias en su procesado. Se analizaron 28 muestras de carne de jabalí destinadas a autoconsumo, procedentes de cacerías autorizadas en el Principado de Asturias (temporada 2024-2025). Se recuperaron cepas de Escherichia coli ExPEC (7,1 %) y aEPEC (10,7 %), identificándose en conjunto 17,9 % de muestras con cepas potencialmente zoonósicas. Se detectaron 10 clonotipos distintos, incluyendo CH65-32 y CH45-97, asociados a humanos y animales. El 32,2 % de las muestras albergaban cepas productoras de BLEE, con varios tipos blaCTX-M, predominando el alelo CTX-M-15. Una cepa portaba simultáneamente blaCTX-M-15 y blaCMY 2, señalando la posible transferencia de elementos genéticos móviles. A nivel filogenético, predominó el grupo B1, con presencia del grupo B2 (14,3 %), asociado a infecciones humanas. Además, Klebsiella pneumoniae se recuperó en el 60,7 % de las muestras, con una cepa productora de BLEE (tipo CTX-M-15). El análisis de riesgo evidenció que incluso las muestras clasificadas como “satisfactorias” según el criterio microbiológico estándar, podían contener indicadores de riesgo relevantes. En conclusión, la carne de jabalí destinada a autoconsumo puede actuar como vehículo de enterobacterias de alto riesgo, como K. pneumoniae y E. coli productoras de BLEE y/o con factores de virulencia, señaladas por la Organización Mundial de la Salud como patógenos críticos en relación con la resistencia a los antimicrobianos (RAM). La elevada prevalencia de K. pneumoniae recuperada en las muestras, aunque con escasa proporción de BLEE, también requiere vigilancia. Nuestros resultados evidencian la necesidad de establecer controles más estrictos sobre la carne de caza y promover buenas prácticas higiénico-sanitarias en su procesado, para garantizar una alimentación segura en el marco de la estrategia “Una sola salud”. [GLG] A carne de caza silvestre, como a do xabaril (Sus scrofa), presenta riscos microbiolóxicos non equiparables aos da carne de animais de granxa, debido á ausencia de controis sanitarios sistemáticos e a diferencias no seu procesado. Analizáronse 28 mostras de carne de xabaril destinadas a autoconsumo, procedentes de cacerías autorizadas no Principado de Asturias (tempada 2024-2025). Recuperáronse cepas de Escherichia coli ExPEC (7,1 %) e aEPEC (10,7 %), identificándose en conxunto 17,9 % de mostras con cepas potencialmente zoonósicas. Detectáronse 10 clonotipos diferentes, incluíndo CH65-32 e CH45-97, asociados a humanos e animais. O 32,2 % das mostras albergaban cepas produtoras de BLEE, con varios tipos blaCTX-M, predominando o alelo CTX-M-15. Unha cepa foi portadora simultaneamente de blaCTX-M-15 e blaCMY-2, sinalando a posible transferencia de elementos xenéticos móbiles. A nivel filoxenético, o grupo B1 foi o predominante, con presencia do grupo B2 (14,3 %), asociado a infeccións humanas. Ademais, Klebsiella pneumoniae recuperouse no 60,7 % das mostras, cunha cepa produtora de BLEE (tipo CTX-M-15). A análise de risco evidenciou que mesmo as mostras clasificadas como “satisfactorias” segundo o criterio microbiolóxico estándar, presentaban indicadores de risco relevantes. En conclusión, a carne de xabaril destinada ao autoconsumo pode actuar como vehículo de enterobacterias de alto risco, como K. pneumoniae e E. coli produtoras de BLEE e/ou con factores de virulencia, sinaladas pola Organización Mundial da Saúde como patóxenos críticos en relación á resistencia aos antimicrobianos (RAM). A elevada prevalencia de K. pneumoniae recuperada nas mostras, aínda que cunha baixa proporción de cepas BLEE, tamén require vixilancia. Os nosos resultados evidencian a necesidade de establecer controis máis estritos sobre a carne de caza e promover boas prácticas hixiénico sanitarias na súa manipulación, co fin de garantir unha alimentación segura no marco da estratexia “Unha soa saúde”. [ENG] Wild game meat, such as wild boar (Sus scrofa), presents microbiological risks that is not comparable to meat from farm animals, due to the absence of systematic health controls and differences in processing. In this study, 28 samples of wild boar meat intended for self-consumption were analyzed, obtained from authorized hunts in the Principality of Asturias (2024-2025 season). Escherichia coli ExPEC (7.1 %) and aEPEC (10.7 %) strains were recovered, with a total of 17.9 % of samples identified as carrying potentially zoonotic strains. Up to 10 different clonotypes were detected, including CH65-32 and CH45-97, associated with humans and animals. A total of 32.2 % of the samples harbored ESBL-producing strains, with several blaCTX-M types, predominantly the CTX-M-15 allele. One strain co-harbored blaCTX-M-15 and blaCMY-2, signaling the posible transfer of mobile genetic elements. At the phylogenetic level, group B1 was predominant, with the presence of group B2 (14.3 %), linked to human infections. Additionally, Klebsiella pneumoniae strains were recovered from 60.7 % of the samples, with an ESBL-producing strain (type CTX-M-15). Risk analysis revealed that even samples classified as “satisfactory” under standard microbiological criteria contained relevant risk indicators. In conclusion, wild boar meat intended for self-consumption can act as a vehicle for high-risk Enterobacteriaceae, such as K. pneumoniae and E. coli producing ESBL and/or carrying virulence factors, listed by the World Health Organization as critical pathogens in relation to antimicrobial resistance (AMR). The high prevalence of K. pneumoniae recovered in the samples, although with a low proportion of ESBL producers, also calls for surveillance. Our results highlight the need to establish stricter controls over game meat and promote good hygienic practices in its handling to ensure food safety, in line ith the “One Health” strategy.
Caracterización de plásmidos de cepas de Escherichia coli patóxenos extraintestinais (ExPEC) multirresistentes aos antibióticos de orixe animal.
(2025) Baños Martínez, Iyana
[SPA] Los plásmidos son una de las principales razones de la diseminación de genes de resistencia a antibióticos y factores de virulencia entre las cepas bacterianas. En este trabajo se ha estudiado la conjugación plasmídica y su frecuencia. Además, se llevó a cabo una caracterización genotípica y fenotípica de las cepas donadoras, de las receptoras y de los transconjugantes obtenidos, con el objetivo de analizar el papel de los plásmidos conjugativos en la fisiología de las células receptoras. Las potenciales cepas donadoras del proceso de conjugación han sido una colección de cepas de Escherichia coli O25b:H4-B2-ST131 clado B, de origen porcino. El hecho de que estas cepas, a pesar de su origen, pertenezcan a un clon típicamente asociado a humanos, como es el ST131 las convierte en un hallazgo inusual y de gran interés. Además, presentan los patotipos ExPEC, APEC y UPEC y son multirresistentes. Por su parte, las cepas receptoras fueron la MG1655 y la AAG1 (una variante mutante de MG1655), cepas comensales de E. coli. Tanto el número de cepas donadoras que han sido capaces de llevar a cabo la conjugación como la cantidad de transconjugantes obtenidos, es decir, la frecuencia de conjugación, mostraron valores muy bajos. Solamente conjugaron 2 de las 9 potenciales cepas donadoras y todas con una frecuencia de conjugación menor al 0,001%. Los dos plásmidos que lograron transferirse pertenecían a las familias IncX4 e IncL/M y confirieron a las cepas receptoras resistencia a antibióticos que previamente no poseían: penicilinas y cefalosporinas de primera generación en ambos casos y, además, a la colistina en el caso del plásmido IncX4, demostrando la implicación de este mecanismo en la diseminación de la resistencia. A pesar de estas bajas frecuencias de transferencia observadas in vitro, la transferencia horizontal de plásmidos sigue siendo uno de los principales mecanismos responsables de la diseminación de genes entre poblaciones bacterianas, facilitando su propagación entre distintos hospedadores y nichos ecológicos. En este contexto, el bloqueo de componentes de la conjugación se ha propuesto como una estrategia prometedora para frenar la diseminación de la resistencia a los antibióticos mediada por plásmidos. En general, los hallazgos de este estudio respaldan la necesidad de profundizar en la comprensión de los mecanismos involucrados en la conjugación bacteriana en cepas de E. coli causantes de infecciones extraintestinales, con el fin de evaluar la viabilidad de esta estrategia desde un enfoque One Health. [GLG] Os plásmidos son unha das principais razóns para a diseminación de xenes de resistencia a antibióticos e factores de virulencia entre as cepas bacterianas. Este traballo estudou a conxugación de plásmidos e a súa frecuencia. Ademais, realizouse unha caracterización xenotípica e fenotípica das cepas doadoras, das receptoras e dos transconxugantes obtidos, co obxectivo de analizar o papel dos plásmidos conxugativos na fisioloxía das células receptoras. As potenciais cepas doadoras do proceso de conxugación foron unha colección de cepas de Escherichia coli O25b:H4-B2-ST131 clado B, de orixe porcino. O feito de que estas cepas, a pesar da súa orixe, pertenzan a un clon típicamente asociado cos humanos, como ST131, convérteas nun achado inusual e de gran interese. Ademais, presentan os patotipos ExPEC, APEC e UPEC e son multirresistentes. As cepas receptoras foron MG1655 e AAG1 (unha variante mutante de MG1655), cepas comensais de E. coli. Tanto o número de cepas doadoras capaces de conxugar como a cantidade de transconxugantes obtidos, é dicir, a frecuencia de conxugación, amosaron valores moi baixos. Só dúas das nove cepas doadoras potenciais conxugaron, e todas cunha frecuencia de conxugación inferior ao 0,001%. Os dous plásmidos que se transferiron con éxito pertencían ás familias IncX4 e IncL/M e confirían resistencia a antibióticos non presentes previamente nas cepas receptoras: penicilinas e cefalosporinas de primeira xeración en ambos os casos, e colistina no caso do plásmido IncX4, o que demostra a implicación deste mecanismo na propagación da resistencia. A pesar destas baixas frecuencias de transferencia observadas in vitro, a transferencia horizontal de plásmidos segue a ser un dos principais mecanismos responsables da diseminación de xenes entre as poboacións bacterianas, facilitando a súa propagación a través de diferentes hóspedes e nichos ecolóxicos. Neste contexto, propúxose o bloqueo dos compoñentes de conxugación como unha estratexia prometedora para frear a propagación da resistencia a antibióticos mediada por plásmidos. En xeral, os resultados deste estudo apoian a necesidade de comprender mellor os mecanismos implicados na conxugación bacteriana en cepas E. coli que causan infeccións extraintestinais, co fin de avaliar a viabilidade desta estratexia desde a perspectiva One Health. [ENG] Plasmids are one of the main reasons for the dissemination of antibiotic resistance genes and virulence factors among bacterial strains. This study analyzed plasmid conjugation and its frequency. Furthermore, genotypic and phenotypic characterization of the donor and recipient strains and the resulting transconjugants was performed to analyze the role of conjugative plasmids in the physiology of recipient cells. The potential donor strains for the conjugation process were a collection of Escherichia coli O25b:H4-B2-ST131 clade B strains of porcine origin. The fact that these strains, despite their origin, belong to a clone typically associated with humans, such as ST131, makes them an unusual and highly interesting find. Furthermore, they present the ExPEC, APEC and UPEC pathotypes and are multidrug-resistant. The recipient strains were MG1655 and AAG1 (a mutant variant of MG1655) commensal strains of E. coli. Both the number of donor strains capable of conjugation and the number of transconjugants obtained, i.e., the conjugation frequency, showed very low values. Only two of the nine potential donor strains conjugated, and all with a conjugation frequency of less than 0.001%. The two plasmids that were successfully transferred belonged to the IncX4 and IncL/M families and conferred resistance to antibiotics not previously present in the recipient strains: penicillins and first-generation cephalosporins in both cases, and colistin in the case of the IncX4 plasmid, demonstrating the involvement of this mechanism in the pread of resistance. Despite these low transfer frequencies observed in vitro, horizontal plasmid transfer remains one of the main mechanisms responsible for gene dissemination among bacterial populations, facilitating their spread across different hosts and ecological niches. In this context, blocking conjugation omponents has been proposed as a promising strategy to curb the spread of plasmid-mediated antibiotic esistance. Overall, the findings of this study support the need to further understand the mechanisms involved in acterial conjugation in E. coli strains that cause extraintestinal infections, in order to evaluate the feasibility of this trategy from a One Health perspective.
Estudio de la influencia del calcio en la activación de la respuesta inflamatoria
(2025) Álvarez Riesgo, Elisa
[SPA] El calcio es un segundo mensajero crucial en numerosos procesos celulares como el metabolismo energético o la activación del sistema inmune. La comunicación que se establece entre la mitocondria y el retículo endoplasmático (RE) para regular sus niveles intracelulares es esencial para el correcto funcionamiento celular y se altera en situaciones de estrés como la inflamación. En este Trabajo Fin de Grado se estudió el papel del calcio en la activación de la respuesta inflamatoria mediante su modulación con tapsigargina (Tg), un compuesto inhibidor irreversible y selectivo de la bomba Ca2+ -ATPasa del RE. Inicialmente, se analizó el efecto de la Tg sobre la viabilidad celular en macrófagos de la línea celular RAW 264.7, obteniéndose una concentración inhibitoria 50 de 0,1 μM tras 24 h de tratamiento. A continuación, se cuantificó la liberación del factor de necrosis tumoral α tras 24 h de tratamiento con Tg, obteniéndose una liberación significativa a concentraciones de 0,1 y 0,01 μM. Seguidamente, se analizó el efecto de este fármaco sobre los niveles de calcio citosólico libre mediante el indicador fluorescente Fura-2AM. Se observó un incremento inicial de calcio citosólico correspondiente con el vaciamiento del RE que causa la Tg, seguido de un leve descenso provocado por la recaptación mitocondrial de Ca2+ y después un aumento debido a la apertura de los canales de calcio dependientes de reservorio. Por último, se evaluó el efecto de la Tg sobre el metabolismo energético, observándose una reducción significativa de la producción del ATP total debido a la disrupción mitocondrial por la sobrecarga de calcio. Además, se detectaron indicios de recuperación celular, asociados a la activación de la glucólisis anaerobia como mecanismo compensatorio. Estos resultados confirman que la modulación del calcio en macrófagos provoca una activación de la respuesta inflamatoria y afecta al metabolismo energético, especialmente a la función mitocondrial. [ENG] Calcium is a crucial second messenger in numerous cellular processes, such as energy metabolism and immune system activation. The communication between mitochondria and the endoplasmic reticulum (ER) to regulate its intracellular levels is essential for proper cell function and is disrupted under stressful situations like inflammation. This Final Degree Project studied the role of calcium in the activation of the inflammatory response through its modulation with thapsigargin (Tg), an irreversible and selective inhibitor of the ER-Ca2+-ATPase pump. Initially, the effect of Tg on cell viability was analyzed in macrophages from RAW 264.7 cell line, obtaining a half inhibitory concentration of 0.1 μM after 24 h of treatment. Next, the release of tumor necrosis factor α was quantified after 24 h of treatment with Tg, obtaining a significant release at concentrations of 0.1 and 0.01 μM. The effect of this drug on free cytosolic calcium levels was then analyzed using the fluorescent indicator Fura-2AM. An initial increase in cytosolic calcium was bserved, corresponding to the ER emptying caused by Tg, followed by a slight decrease caused by mitochondrial Ca2+ reuptake and then an increase due to the opening of store-operated channels. Finally, the effect of Tg on energy metabolism was evaluated, revealing a significant reduction in total ATP production due to the mitochondrial disruption caused by calcium overload. Furthermore, signs of cellular recovery were detected, associated to the activation of anaerobic glycolysis as a compensatory mechanism. These results confirm that calcium modulation in macrophages triggers an activation of the inflammatory response and affects energy metabolism, particularly mitochondrial function. [GLG] O calcio é un segundo mensaxeiro crucial en numerosos procesos celulares, como o metabolismo enerxético e a activación do sistema inmunitario. A comunicación entre as mitocondrias e o retículo endoplasmático (RE) para regular os seus niveis intracelulares é esencial para o correcto funcionamento celular e vese alterada en situacións de estrés como a inflamación. Este Traballo Fin de Grao estuda o papel do calcio na activación da resposta inflamatoria a través da súa modulación con tapsigarxina (Tg), un inhibidor irreversible e selectivo da bomba de Ca2+-ATPasa do RE. Inicialmente, analizouse o efecto da Tg sobre a viabilidade celular en macrófagos da liña celular RAW 264.7, obtendo unha concentración inhibitoria 50 de 0,1 μM despois de 24 h de tratamento. A continuación, cuantificouse a liberación do factor de necrose tumoral α despois de 24 h de tratamento con Tg, obtendo unha liberación significativa a concentracións de 0,1 e 0,01 μM. Analizouse entón o efecto deste fármaco sobre os niveis de calcio citosólico libre utilizando o indicador fluorescente Fura-2AM. Observouse un aumento inicial do calcio citosólico, correspondente ao baleirado do RE causado pola Tg, seguido dunha lixeira diminución causada pola recaptación de Ca2+ mitocondrial e, a continuación, un aumento debido á apertura dos canais de calcio regulados por reservorio. Finalmente, avaliouse o efecto da Tg no metabolismo enerxético, revelando unha redución significativa na produción total de ATP debido á disrupción mitocondrial causada pola sobrecarga de calcio. Ademais, detectáronse signos de recuperación celular, asociados á activación da glicólise anaerobia como mecanismo compensatorio. Estes resultados confirman que a modulación do calcio nos macrófagos desencadea unha activación da resposta inflamatoria e afecta ao metabolismo enerxético, en particular á función mitocondrial.

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