Desenvolvemento de novas tecnoloxías para o illamento de exosomas mediante o uso de sistemas biolóxicos vivos

Abstract

[GLG] Os exosomas son un tipo de vesículas extracelulares cuxa bioxénese ocorre na vía endosómica da célula. A súa secreción é un proceso evolutivamente conservado e sábese que desenvolven un papel crucial na comunicación intercelular. Estas vesículas, transportan proteínas transmembrana ou compoñentes citoplasmáticos, o que amosa o seu potencial como biomarcadores non invasivos para o diagnóstico de diversas patoloxías como o cancro. Non obstante, na actualidade os protocolos son moi complexos e custosos, polo que se require desenvolver novas técnicas.

Neste estudo, búscase crear un novo protocolo que permita illar exosomas humanos mediante o emprego da tecnoloxía de presentación en superficie de lévedos, que permite a expresión de proteínas recombinantes na parede celular. Neste caso, o dominio extracelular de Tim4 (Tim4D), que ten a capacidade de recoñecer residuos de fosfatidilserina presentes na membrana dos exosomas. Tim4D foi clonado nos plásmidos pYD1, pYD5 e pCTcon2 e expresado na cepa EBY100 de S.cerevisiae, co obxectivo de validar o seu uso como sistema de captura de exosomas.

Os procedementos incluíron clonación por recombinación homóloga, transformación bacteriana e en lévedos, e análise da expresión mediante técnicas como Western Blot, Dot Blot e citometría de fluxo. A expresión de Tim4D na superficie dos lévedos suxire que esta metodoloxía podería ser unha alternativa viable, barata e eficiente aos métodos tradicionais de illamento de exosomas.

Con todo, o emprego de técnicas máis complexas e a análise dos reactivos que compoñen os medios de cultivo mellorarían a detección da expresión da proteína de fusión para a aplicación dos exosomas en investigación biomédica e terapias baseadas en vesículas extracelulares.[SPA] Los exosomas son un tipo de vesículas extracelulares cuya biogénesis ocurre en la vía endosómica de la célula. Su secreción es un proceso evolutivamente conservado y se sabe que desarrollan un papel crucial en la comunicación intercelular. Estas vesículas, transportan proteínas transmembrana o componentes citoplasmáticos, lo que demuestra su potencial como biomarcadores no invasivos para el diagnóstico de diversas patologías como el cáncer. No obstante, en la actualidad los protocolos son muy complejos y costosos, por lo que se requiere desarrollar nuevas técnicas.

En este estudio, se busca desarrollar un nuevo protocolo que permita aislar exosomas humanos mediante el uso de la tecnología de presentación en superficie de levaduras, que permite la expresión de proteínas recombinantes en la pared celular. En este caso, el dominio extracelular de Tim4 (Tim4D), que tiene la capacidad de reconocer residuos de fosfatidilserina presentes en la membrana de los exosomas. Tim4D fue clonado en los plásmidos pYD1, pYD5 y pCTcon2 y expresado en la cepa EBY100 de S.cerevisiae, con el objetivo de validar su uso como sistema de captura de exosomas.

Los procedimientos incluyeron clonación por recombinación homóloga, transformación bacteriana y en levaduras, y análisis de la expresión génica mediante técnicas como Western Blot, Dot Blot y citometría de flujo. La expresión de Tim4D en la superficie de las levaduras sugiere que esta metodología podría ser una alternativa viable, barata y eficiente a los medios tradicionales de aislamiento de exosomas.

Con todo, el empleo de técnicas más complejas y el análisis de los reactivos que componen los medios de cultivo, mejorarían la detección de la expresión de la proteína de fusión para la aplicación de los exosomas en investigación biomédica y terapias basadas en vesículas extracelulares.[ENG] Exosomes are a type of extracellular vesicle whose biogenesis occurs in the cell’s endosomal pathway. Their secretion is an evolutionarily conserved process, and they are known to play a crucial role in intercellular communication. The vesicles transport transmembrane proteins or cytoplasmic components, demonstrating their potential as non-invasive biomarkers for the diagnosis of various pathologies such as cancer. However, current protocols are very complex and expensive, necessitating the development of new techniques.

This study seeks to create a new protocol for isolating human exosomes using yeast surface display technology, which allows for the expression of recombinant proteins in the cell wall. In this case, the extracellular domain of Tim4 (Tim4D), that has the ability to recognize phosphatidylserine residues present in the exosome membrane. Tim4D was cloned into plasmids pYD1, pYD5 and pCTcon2 and expressed in the S.cerevisiae strain EBY100, with the aim of validating its use as an exosome capture system.

This work included cloning by homologous recombination, bacterial and yeast transformation, and gene expression analysis using techniques such as Western Blot,Dot Blot and flow cytometry. The expression of Tim4D on the surface of yeast suggests that this methodology could be a viable, inexpensive and efficient alternative to traditional methods of exosome isolation.

However, the use of more complex techniques and the analysis of the reagents in the culture media would improve the detection of fusion protein expression for the application of exosomes in biomedical research and extracellular vesicle-based therapies.