Detección rápida de biofilms de Listeria monocytogenes en superficies mediante amplificación isotérmica de ADN

Abstract

[SPA] Listeria monocytogenes es un patógeno de transmisión alimentaria de alta relevancia a nivel global por su elevada tasa de mortalidad. Su gran capacidad de adaptación a condiciones ambientales adversas y su capacidad para formar biofilms aumentan su resistencia y dificultan su eliminación. Las técnicas de diagnóstico tradicionales, basadas en el cultivo bacteriano, requieren de varios días para determinar la muestra como positiva. Para solventar estos problemas, en los últimos años se han desarrollado técnicas moleculares más rápidas y sensibles como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y el LAMP (amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle). En este trabajo se desarrolló un método rápido de detección de biofilms de L. monocytogenes en superficies de acero inoxidable mediante LAMP. Para ello se evaluó la recuperación de células de los biofilms con distintos tratamientos (PBS, LPT y LPT-PRN), el impacto del enriquecimiento de las muestras en TSB durante 3 horas y la purificación del ADN previo a la amplificación. Los resultados demostraron que el método LAMP, tanto en su formato a tiempo real como colorimétrico, permite detectar L. monocytogenes en biofilms monoespecie y mixtos a concentraciones superiores a 3,9 log UFC/cm2, con mejoras notables tras un enriquecimiento de 3 horas y la purificación del ADN de las muestras. Este formato colorimétrico puede llevarse a cabo utilizando únicamente un termobloque, sin necesidad de equipos especializados, lo que lo convierte en una herramienta accesible, rápida y robusta para su aplicación en entornos industriales.[GLG] Listeria monocytogenes é un patóxeno de transmisión alimentaria de alta relevancia a nivel global pola súa elevada tasa de mortalidade. A súa gran capacidade de adaptación a condicións ambientais adversas e a súa capacidade para formar biofilms aumentan a súa resistencia e dificultan a súa eliminación. As técnicas de diagnóstico tradicionais, baseadas no cultivo bacteriano, requiren de varios días para determinar a mostra como positiva. Para solventar estes problemas, nos últimos anos desenvolvéronse técnicas moleculares máis rápidas e sensibles como a PCR (reacción en cadea da polimerasa) e o LAMP (amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle). Neste traballo desenvolveuse un método rápido de detección de biofilms de L. monocytogenes en superficies de acero inoxidable mediante LAMP. Para isto evaluouse a recuperación de células dos biofilms con distintos tratamentos (PBS, LPT e LPT-PRN), o impacto do enriquecimento das mostras en TSB durante 3 horas e a purificación do ADN. Os resultados demostraron que o método LAMP, tanto no formato a tempo real como colorimétrico, permite detectar L. monocytogenes en biofilms monoespecie e mixtos a concentracións superiores a 3,9 log UFC/cm2, con melloras notables tras un enriquecimento de 3 horas e a purificación do ADN das mostras. Este formato colorimétrico pode levarse a cabo empregando unicamente un termobloque, sen necesidade de equipos especializados, o que o converte nunha ferramenta accesible, rápida e robusta para a súa aplicación en entornos industriais.[ENG] Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen of high global relevance due to its high mortality rate. Its great ability to adapt to adverse environmental conditions and its ability to form biofilms increase its resistance and make its removal difficult. Traditional diagnostic techniques, based on bacterial culture, require several days to determine the sample as positive. To solve these problems, faster and more sensitive molecular techniques such as PCR (polymerase chain reaction) and LAMP (loop-mediated isothermal amplification of DNA) have been developed in recent years. In this study, a rapid method of detection of L. monocytogenes biofilms on stainless steel surfaces by LAMP was developed. To this end, the recovery of cells from the biofilms with different treatments (PBS, LPT and LPT-PRN), the impact of enriching the samples in TSB for 3 hours and DNA purification were evaluated. The results showed that the LAMP method, both in its real-time and colorimetric formats, allows the detection of L. monocytogenes in single-species and mixed biofilms at concentrations above log 3.9 CFU/cm2, with notable improvements after 3-hours enrichment and DNA purification of the samples. This colorimetric format can be carried out using only a thermoblock, without the need for specialized equipment, which makes it an accessible, fast and robust tool for application in industrial environments.