Detección y cuantificación de ADN mediante intercaladores

Abstract

[ESP] La proflavina (PF) es un colorante con una amplia variedad de usos; desde su papel como antiséptico o antitumoral hasta su papel como marcador de ácidos nucleicos, es una molécula capaz de intercalar la doble cadena de ADN, proceso en el cual una molécula plana se inserta entre los pares de bases del ADN. Muchos trabajos se basan en el estudio de la interacción de la PF y el ADN, ya que su mayor interés recae en su papel como fluorocromo económico que permita detectar y, en otros casos, cuantificar el ADN amplificado mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La formación de un complejo intercalado menos fluorescente se puede observar mediante el uso de técnicas espectroscópicas de absorción Vis-UV y de fluorescencia. En este trabajo se realizaron estudios de caracterización de la proflavina para determinar cómo la intercalación de la PF en el ADN se puede ver afectada por la fuerza iónica del medio y por la carga del catión presente en la sal. Para ello se determinaron las constantes de afinidad de la PF con ADN en presencia de diferentes concentraciones de sales de Mg2+ y de Na+. Los resultados obtenidos demostraron que dicha constante disminuye al aumentar la fuerza iónica de la disolución y que el Mg2+ produce una mayor disminución en la constante de afinidad que el Na+. Finalmente, se cuantificó el ADN amplificado mediante LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) utilizando proflavina como colorante, comparando estos valores con los obtenidos utilizando otro intercalador y un colorante comercial.[GAL] A proflavina (PF) é un colorante cunha ampla variedade de usos; dende o seu papel como antiséptico ou antitumoral ata o seu papel como marcador de ácidos nucleicos, é unha molécula capaz de intercalar a dobre cadea do ADN, proceso no cal unha molécula plana se insire entre os pares de bases do ADN. Moitos traballos están baseados no estudo da interacción da PF e o ADN, xa que o maior interese recae no seu papel como fluorocromo económico que permita detectar e, noutros casos, cuantificar o ADN amplificado mediante a Reacción en Cadea da Polimerasa (PCR). A formación dun complexo intercalado menos fluorescente pódese observar mediante o uso de técnicas espectroscópicas de absorción Vis-UV e de fluorescencia. Neste traballo realizáronse estudos de caracterización da PF para determinar como a intercalación da PF no ADN está afectada pola forza iónica do medio e pola carga do catión presente no sal. Para iso determináronse as constantes de afinidade da PF co ADN en presenza de diferentes concentracións de sales de Mg2+ e de Na+. Os resultados obtidos demostraron que devandita constante diminúe ao aumentar a forza iónica da disolución e que o Mg2+ produce unha maior diminución na constante de afinidade co Na+. Finalmente, o ADN amplificado mediante LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) cuantificouse utilizando proflavina como colorante, comparando estes valores cos obtidos empregando outro intercalador e un colorante comercial.[ENG] Proflavine (PF) is a dye with countless uses; from its role as an antiseptic or antitumor to its role as a nucleic acid marker, this molecule can intercalate the double strand of DNA, a process where a flat molecule is inserted between the base pairs of DNA. Many works are based on the study of the interaction of PF and DNA, since the greatest interest lies in its role as a cheaper fluorochrome that allows detecting and, in other cases, quantifying DNA amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR). The formation of a less fluorescent intercalated complex can be observed by using Vis-UV absorption and fluorescence spectroscopic techniques. In this work, we characterized PF to determine how its intercalation in DNA can be affected by the ionic strength of the medium and charge of the cation present in the salt. For this purpose, the affinity constants of PF with DNA were determined in the presence of different concentrations of Mg2+ and Na+ salts. Results demonstrated that this constant decreases as the ionic strength of the solution increases and that Mg2+ produces a bigger decrease in the affinity constant than Na+. Finally, the amplified DNA by LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) was quantified using proflavine as a dye, and these results were compared with others obtained using a different intercalator and a commercial dye.