Desenvolvemento e caracterización de liñas celulares de peixe cebra en estadios embrionarios e adultos, tanto de tipo salvaxes como mutantes, para aplicacións en estudos bioquímicos e moleculares

Abstract

[SPA] El desarrollo y la caracterización de líneas celulares de pez cebra requiere de la elaboración de un protocolo que facilite su establecimiento. Actualmente existen pocas metodologías optimizadas para este modelo, a pesar de su creciente importancia en investigación biomédica y genética. Este trabajo tiene como objetivo diseñar una metodología para generar cultivos celulares a partir de embriones y peces cebra adultos, tanto de tipo salvajes como mutantes. La finalidad común es la estandarización de las condiciones óptimas para el cultivo de sus células, independientemente del genotipo de origen.

Se evaluaron distintas condiciones de disgregación celular, utilizando enzimas proteolíticas como tripsina y pronasa y se utilizó medio de cultivo L-15, suplementado con distintas concentraciones de FBS, y bajo diferentes formas de esterilización. También, se exploró la transformación vírica con retrovirus SnRV como estrategia de inmortalización. Se llevaron a cabo ensayos de cultivo celular a partir de embriones en estadios de 30% y 50% de epibolia, estadio de yema y fase faringular Prim-5, con el fin de preservar su viabilidad celular, evitando el desarrollo de embriones hasta etapas más avanzadas y, de este modo, reduciendo el uso de animales en la experimentación. Asimismo, se iniciaron ensayos para el desarrollo de líneas celulares derivadas de corazón, intestino, ojos, músculo y cerebro extraído de peces cebra adultos, comparando individuos salvajes y mutantes.

Aunque se logró la siembra inicial y se observaron signos tempranos de adherencia y viabilidad en algunas condiciones, la mayoría de los cultivos no consiguieron mantenerse de forma estable a largo plazo. Con todo, este trabajo sienta las bases metodológicas para futuras optimizaciones orientadas al establecimiento efectivo de líneas celulares. Este proyecto no solo contribuye al avance del conocimiento en biomedicina, sino que también promueve un enfoque más ético y sostenible en la investigación científica.

[GLG] O desenvolvemento e caracterización de liñas celulares de peixe cebra requiren da creación dun protocolo que facilite o seu establecemento. Actualmente existen poucas metodoloxías optimizadas para este modelo, malia a súa crecente importancia en investigación biomédica e xenética. Este traballo ten como obxectivo deseñar unha metodoloxía para xerar cultivos celulares a partir de embrións e peixes cebra adultos, tanto de tipo salvaxes coma mutantes. A finalidade común é a estandarización das condicións óptimas para o cultivo das súas células, independentemente do xenotipo de orixe.

Avaliáronse distintas condicións de disgregación celular, empregando enzimas proteolíticas como tripsina e pronasa, e empregouse medio de cultivo L-15, suplementado con distintas concentracións de FBS, e baixo diferentes formas de esterilización. Tamén, foi explorada a transformación vírica con retrovirus SnRV como estratexia de inmortalización. Leváronse a cabo ensaios de cultivo celular a partir de embrións en estadios de 30% e 50% de epibolia, estadio de xema e fase faringular Prim-5, co obxectivo de preservar a súa viabilidade celular, evitando o desenvolvemento de embrións ata etapas máis avanzadas e, deste xeito, reducindo o uso de animais na experimentación. Asemade, iniciáronse ensaios para o desenvolvemento de liñas celulares derivadas de corazón, intestino, ollos, músculo e cerebro extraídos de peixe cebra adultos, comparando individuos salvaxes e mutantes.

Aínda que se acadou a sementeira inicial e se observaron os primeiros signos de adherencia e viabilidade en algunhas condicións, a maioría dos cultivos non conseguiron manterse de xeito estable a longo prazo. Con todo, este traballo senta as bases metodolóxicas para futuras optimizacións orientadas ao establecemento efectivo de liñas celulares. Este proxecto non só contribúe ao avance do coñecemento en biomedicina, senón que tamén promove un enfoque máis ético e sostible na investigación científica.

[ENG] The development and characterization of zebrafish cell lines require the establishment of a protocol that facilitates their derivation. Currently, there are few optimized methodologies for this model, despite its growing importance in biomedical and genetic research. This work aims to design a methodology to generate cell cultures from both embryos and adult zebrafish, including wild-type and mutant specimens. The common goal is to standardize the optimal conditions for culturing their cells, regardless of the genotype of origin.

Different conditions for cell dissociation were evaluated, using proteolytic enzymes such as trypsin and pronase and L-15 culture medium was used, supplemented with various concentrations of FBS and under different sterilization methods. Also, viral transformation using SnRV retrovirus was also explored as a strategy for immortalization. Cell culture assays were carried out using embryos at the 30% and 50% epiboly stages, yolk stage, and the pharyngula Prim-5 stage, with the goal of preserving cell viability by avoiding embryo development to more advanced stages and thus reducing the use of animals in experimentation. Likewise, assays were initiated for the development of cell lines derived from the heart, intestine, eyes, muscle, and brain extracted from adult zebrafish, comparing wild-type and mutant individuals.

Although initial seeding was achieved and early signs of adhesion and viability were observed under some conditions, most cultures failed to remain stable in the long term. However, this work lays the methodological groundwork for future optimizations aimed at the effective establishment of cell lines. This project not only contributes to the advancement of biomedical knowledge but also promotes a more ethical and sustainable approach to scientific research.