Desenvolvemento dun método rápido para asegurar a identidade varietal en aceites de oliva

Abstract

[GLG] O aceite de oliva é un dos produtos cun maior risco de adulteración tanto polos seus elevados beneficios para a saúde e elevada calidade, como polo grande impacto socio-económico e alto prezo de mercado. O fraude alimentario pode deberse tanto á mestura con aceites vexetais máis baratos como á falsificación do orixe, cultivar ou categoría. Para previlo, é moi importante poder realizar análises rápidos, sensibles e in-situ en diferentes puntos da cadea de suministro, asegurando a súa trazabilidade e autenticidade para protexer aos consumidores e apoiar aos produtores(1).

O obxectivo do presente traballo é desenvolver un método baseado en ADN para detectar variedades de olivo, e integrar este método nun dispositivo miniaturizado que poda ser aplicado en diferentes puntos da cadea de valor, dende granxas ata empresas alimentarias. A detección baséase no xenotipado de SNPs (Single Nucleotide Polimorfisms)(2).

Para o desenvolvemento do método, empregáronse oito mostras de olivas e follas procedentes de Chipre e Turquía. Antes de comenzar, caracterizáronse morfolóxicamente atentendo a caracteres do endocarpo, determinando a identidade e autenticidade varietal. Unha vez identificadas, o ADN de todas as mostras foi extraído para amplificar rexións dos xenes Cicloartenol sintase (OEX) e Lupeol sintase (OEW) mediante end-point PCR, e os amplicóns visualizáronse mediante electroforese en xel. Finalmente, estes secuenciáronse (Sanger Sequencing by Macrogen) para a súa análise bioinformática (3,4).

Mediante a análise bioinformática empregando Geneious Prime Software, primeiro correxíronse as secuencias individuais para posteriormente alinear todas as variedades de cada xen (con secuencias baixadas de referencia depositadas na base de datos GenBank), e atopar marcadores específicos (SNPs) que permitan a identificación das variedades en matrices complexas(4,5). Con estes marcadores diseñáronse sondas para realizar ensaios de xenotipado TaqMan® que permitan discriminar dous alelos cunha soa diferenza nucleotídica. Esta discriminación baséase na hibridación específica das sondas, para o que se empregan dous colorantes diferentes, VIC e FAM. Deste xeito, poden amplificarse e detectarse alelos específicos no ADN xenómico (ADNg) mediante unha qPCR.[SPA] El aceite de oliva es uno de los productos con mayor riesgo de adulteración tanto por sus elevados beneficios para la salud y su alta calidad, como por el gran impacto socioeconómico y alto precio de mercado. El fraude alimentario puede deberse tanto a la mezcla con aceites vegetales más baratos como a la falsificación del origen, cultivar o categoría. Para prevenirlo, es muy importante poder realizar análisis rápidos, sensibles y en-situ en diferentes puntos de la cadena de suministro que aseguren su trazabilidad y autenticidad para proteger a los consumidores y apoyar a los productores(1).

El objetivo del presente trabajo es desarrollar un método basado en ADN mediante genotipado de SNPs (Single Nucleotide Polimorfisms) para detectar variedades de olivo. Luego, se busca integrar este método en un dispositivo miniaturizado que pueda aplicarse en diferentes puntos de la cadena de valor, desde granjas hasta empresas alimentarias.

Para el desarrollo del método se utilizaron ocho muestras de aceitunas y hojas procedentes de Chipre y Turquía. Antes de comenzar, se caracterizaron morfológicamente atendiendo a caracteres del endocarpo, determinando la identidad y autenticidad varietal. Una vez identificadas, se extrajo el ADN de todas las muestras para amplificar ciertas regiones de los genes Cicloartenol sintasa (OEX) y Lupeol sintasa (OEW) mediante PCR de punto final, y los amplicones se visualizaron mediante electroforesis en gel. Finalmente, se secuenciaron (Secuenciación Sanger por Macrogen) para su análisis bioinformático.

Con el análisis bioinformático, usando Geneious Prime Software, se corrigieron las secuencias individuales y para luego alinearlas junto con secuencias descargadas de GenBank para cada gen, y así encontrar marcadores específicos (SNPs) que permitan la identificación en matrices complejas. Con estos marcadores, se diseñaron sondas para realizar ensayos de genotipado TaqMan® y así discriminar dos alelos con una sola diferencia nucleotídica. La discriminación se basa en la hibridación específica de las sondas marcadas con dos colorantes diferentes: VIC y FAM. Así se consigue amplificar y detectar específicos en el ADN genómico (ADNg) mediante qPCR.[ENG] Olive oil is one of the products with highest risk of adulteration, both for its high health benefits and high quality, as well as for its great socioeconomic impact and elevated market price. Food fraud can occur by blending it with cheaper vegetable oils and, but also by falsifying the origin, cultivar or category. To prevent it, it is very important to be able to perform rapid, sensitive and on-site analyses at different points of the supply chain to ensure traceability and authenticity to protect consumers and support producers (1).

The objective of the present study is to develop a DNA-based method by SNPs genotyping (Single Nucleotide Polymorphisms) to detect olive varieties. Then, the aim is to integrate this method in a miniaturized device that can be applied in different points of the value chain, from farms to food companies.

Eight samples of olives and leaves from Cyprus and Turkey were used to develop the method. Before starting, they were morphologically characterised according to endocarp traits, determining varietal identity and authenticity. Once identified, DNA was extracted from all samples to amplify certain regions of the Cycloartenol synthase (OEX) and Lupeol synthase (OEW) genes by end-point PCR, and the amplicons were visualised by gel electrophoresis. Finally, they were sequenced (Sanger sequencing by Macrogen) for bioinformatics analysis.

With the bioinformatics analysis, using Geneious Prime Software, the individual sequences were corrected and then aligned with sequences downloaded from GenBank for each gene, to find specific markers (SNPs) that allow identification in complex matrices. With these markers, probes were designed to perform TaqMan® genotyping assays to discriminate two alleles with a single nucleotide difference. The discrimination is based on the specific hybridisation of the probes labelled with two different dyes: VIC and FAM. Thus, specific amplification and detection of genomic DNA (gDNA) is achieved by qPCR.