Purificación y caracterización de una isoforma de subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de AMPc específica de espermatozoides de mejillón Mytilus galloprovincialis

Abstract

[ESP] La proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) es una enzima indispensable para la regulación de numerosos procesos celulares. Está formada por un dímero de subunidades reguladoras (R) y dos subunidades catalíticas (C). En mamíferos y en otros organismos, como mejillón Mytilus galloprovincialis se han identificado diferentes isoformas de las subunidades R y C. Además, los estudios sugieren que la subunidad C4 aislada a partir de manto de mejillón es específica de espermatozoides y por tanto podría ser homóloga de Cα2 de mamíferos. A diferencia de otros organismos como mamíferos y peces, el mecanismo de activación de la motilidad espermática en mejillón es todavía desconocido. Además, existen evidencias de que el aumento de la temperatura del agua del mar afecta negativamente a la motilidad espermática de moluscos. Por tanto, para poder comprender el impacto que tienen estas alteraciones del medio acuático en la tasa de fecundación de estos organismos, es imprescindible conocer los mecanismos que subyacen a este proceso. Por esta razón, este TFG se llevó a cabo como paso previo a la determinación de la influencia de la temperatura en la motilidad espermática. El objetivo del trabajo consistió en purificar y caracterizar la subunidad C4 a partir de manto de mejillones macho. La purificación se logró mediante dos cromatografías sucesivas: (1) DEAE-Sephadex que retiene la PKA a través de las subunidades R y las C fueron eluidas con AMPc. (2) Mono-S que retiene las subunidades C que posteriormente fueron eluidas con NaCl. Finalmente, se determinó la actividad enzimática y el reconocimiento mediante Western Blotting de la subunidad C en las diferentes fracciones obtenidas tras la cromatografía Mono-S. Adicionalmente, también se determinó el peso molecular de la subunidad, de aproximadamente 41 kDa.[GAL] A proteína quinasa dependente de AMPc (PKA) é unha enzima indispensable para a regulación de numerosos procesos celulares. Está formada por dúas subunidades reguladoras (R) e dúas subunidades catalíticas (C). En mamíferos e noutros organismos, como mexillón Mytilus galloprovincialis indentificáronse diferentes isoformas das subunidades R e C. Ademais, os estudos realizados suxiren que a subunidade C4 aislada a partir de manto de mexillón é específica de espermatozoides e polo tanto podería ser homóloga de Cα2 de mamíferos. A diferenza de outros organismos como mamíferos e peixes, o mecanismo de activación da motilidade espermática en mexillón é aínda descoñecido. Ademais, existen evidencias de que o aumento da temperatura da auga do mar afecta negativamente á motilidade espermática de moluscos. Polo tanto, para poder comprender o impacto que teñen estas alteracións do medio acuático na tasa de fecundación destos organismos, é imprescindible coñecer os mecanismos agochados detrás deste proceso. Por esta razón, este TFG levouse a cabo como paso previo á determinación da influenza da temperatura na motilidade espermática. O obxectivo do traballo baseouse en purificar e caracterizar a subunidade C4 a partir de manto de mexillóns macho. A purificación logrouse mediante dúas cromatografías sucesivas: (1) DEAE-Sephadex que retén a PKA a través das subunidades R e as C foron eluidas con AMPc. (2) Mono-S que retén as subunidades C que posteriormente foron eluidas con NaCl. Finalmente, determinouse a actividade enzimática e o recoñecemento mediante Western Blotting da subunidade C nas diferentes fraccións obtidas tras a cromatografía Mono-S. Adicionalmente, tamén se determinou o peso molecular da subunidade, de aproximadamente 41 kDa.[ENG] cAMP-dependent protein kinase (PKA) is essential for the regulation of numerous celular process. Different isoforms of the R and C subunits have been identified in mammals and other organism as the mussel Mytilus galloprovincialis. In addition, studies suggest that the C4 subunit isolated from mussel mantle is sperm specific and therefore could be homologous to mammalian Cα2. In contrast to other organisms such as mammals and fish, the mechanism of sperm motility activation in mussel is still unknown. Furthermore, there is evidence that rising sea temperatura negatively affects sperm motility in mollusks. Therefore, in order to understand the impact of these alterations in the aquatic environment on the fertilization rate of these organisms, it is essential to know the mechanisms underlying this process. For this reason, this TFG was carried out as a preliminary step to determine the influence of temperature on sperm motility. The objective of this work was to purify and characterize the C4 subunit from male mussel mantle. Purification was achieved by two successive chromatographies: (1) DEAE-Sephadex that retains PKA through the R subunits and the C subunits are eluted with cAMP; (2) Mono-S that retains the C subunits that are subsequently eluted with NaCl. Finally, the enzymatic activity and the recognition by western blotting of the C subunit in the different fractions obtained after Mono-S chromatography were determined. In addition, the molecular weight of the subunit of approximately 41 kDa was determined.