Deleción de genes del resistoma secundario de Escherichia coli de origen animal y/o humana resistente a cefotaxima

Abstract

[SPA] La rápida diseminación de la resistencia a los antimicrobianos a nivel mundial constituye una de las principales amenazas para la salud pública actual. La escasez de tratamientos eficaces frente a infecciones causadas por bacterias multirresistentes (MDR) subraya la necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y profilácticas. En este contexto, la OMS ha clasificado a las Enterobacterias resistentes a cefalosporinas de tercera generación como “prioridad crítica”, debido a su potencial para causar infecciones graves y a la limitación de terapias efectivas para combatirlas. Este estudio investiga el papel del gen mnmA, perteneciente al resistoma secundario (RS) de Escherichia coli, frente a la cefotaxima (CTX), en cepas clínicas de E.coli resistentes a dicho antibiótico, dado que las proteínas codificadas por genes de RS podrían representar dianas para fármacos adyuvantes. Mediante mutagénesis dirigida, se delecionó el gen mnmA sustituyéndolo por una casete de resistencia a Kan codificada en el plásmido pKD4. En las colonias mutantes obtenidas se determinó el perfil de resistencia a CTX mediante el análisis de la concentración mínima inhibitoria (MIC) y se compararon con los valores obtenidos en las cepas silvestres correspondientes. Adicionalmente, se evaluó si la deleción del gen mnmA afectaba el crecimiento de las cepas en presencia de CTX —concentración aproximada de 1/2 de la MIC determinada para la cepa silvestre— y, por tanto, su susceptibilidad al antibiótico, mediante un ensayo “TimeKill Assay”. Los resultados evidenciaron que mnmA forma parte del RS de E.coli frente a CTX, ya que su deleción aumenta la susceptibilidad bacteriana al antibiótico observando una disminución de la MIC de CTX en las cepas mutantes (entre 4-8 veces) respecto a las cepas silvestres correspondientes. Además, el ensayo “Time-Kill Assay” en presencia de CTX mostró una reducción gradual de las UFC/mL a lo largo del tiempo en las cepas mutantes en comparación con las cepas silvestres. [GLG] A rápida diseminación da resistencia aos antimicrobianos a nivel mundial constitúe unha das principais ameazas para a saúde pública actual. A escaseza de tratamentos eficaces fronte a infeccións causadas por bacterias multirresistentes (MDR) subliña a necesidade de desenvolver novas estratexias terapéuticas e profilácticas. Neste contexto, a OMS clasificou ás Enterobacterias resistentes a cefalosporinas de terceira xeración como "prioridade crítica", debido ao seu potencial para causar infeccións graves e á limitación de terapias efectivas para combatelas. Este estudo investiga o papel do xene mnmA, pertencente ao resistoma secundario (RS) de Escherichia coli, fronte á cefotaxima (CTX), en cepas clínicas de E.coli resistentes ao dito antibiótico, dado que as proteínas codificadas por xenes do RS poderían representar dianas para fármacos adxuvantes. Mediante mutaxénese dirixida, delecionouse o xene mnmA substituíndoo por unha casete de resistencia a Kan codificada no plásmido pKD4. Nas colonias mutantes obtidas determinouse o perfil de resistencia a CTX mediante a análise da concentración mínima inhibitoria (MIC) e comparáronse cos valores obtidos nas cepas silvestres correspondentes. Adicionalmente, avaliouse se a deleción do xene mnmA afectaba ao crecemento das cepas en presenza de CTX concentración aproximada de 1/2 da MIC determinada para a cepa silvestre— e, por tanto, a súa susceptibilidade ao antibiótico, mediante un ensaio "Time-Kill Assay". Os resultados evidenciaron que mnmA forma parte do RS de E.coli fronte a CTX, xa que a súa deleción aumenta a susceptibilidade bacteriana ao antibiótico observando unha diminución da MIC de CTX nas cepas mutantes (entre 4-8 veces) respecto ás cepas silvestres correspondentes. Ademais, o ensaio "Time-Kill Assay" en presenza de CTX mostrou unha redución gradual das UFC/mL ao longo do tempo nas cepas mutantes en comparación coas cepas silvestres. [ENG] The rapid global spread of antimicrobial resistance is one of the main threats to current public health. The scarcity of effective treatments for infections caused by multidrug-resistant bacteria (MDR) underscores the urgent need to develop new therapeutic and prophylactic strategies. In this context, the WHO has classified third-generation cephalosporin-resistant Enterobacteriaceae as a "critical priority", due to their potential to cause serious infections and the limited effective therapies available to combat them. This study investigates the role of the mnmA gene, belonging to the secondary resistome (RS) of Escherichia coli, against cefotaxime (CTX) in clinical E.coli strains resistant to this antibiotic, since the proteins encoded by RS genes could represent targets for adjuvant drugs. Using sitedirected mutagenesis, the mnmA gene was deleted and replaced by a Kan resistance cassette encoded on the pKD4 plasmid. The CTX resistance profile of the obtained mutant colonies was determined by the analysis of the minimum inhibitory concentration (MIC) and compared with the values obtained in the corresponding wild-type strains. Additionally, we evaluated whether mnmA gene deletion affected the growth of the strains in the presence of CTX —at approximately 1/2 the wild-type strain’s determined MIC— and, therefore, their susceptibility to the antibiotic, using a "Time-Kill Assay". The results showed that mnmA is part of the RS of E.coli against CTX, asits deletion increases bacterial susceptibility to the antibiotic observing a decrease in CTX MIC in mutant strains (4-8- fold) compared to their corresponding wild-type strains. In addition, the "Time-Kill Assay" in the presence of CTX showed a gradual reduction in CFU/mL over time in the mutant strains compared to wild-type strains.