Cabanas Trevin, Lucía2023-03-172023-03-172022http://hdl.handle.net/10347/30354La epilepsia dependiente de piridoxina (EDP) es una enfermedad rara producida por la mutación en el gen ALDH7A1 que codifica para la antiquitina (ATQ), una enzima que participa en el metabolismo degradativo de la L-lisina. El déficit de antiquitina produce una interrupción del catabolismo de dicho aminoácido, que se traduce en la acumulación de metabolitos tóxicos (responsables de la afectación cognitiva) y en el desequilibrio entre neurotransmisores inhibidores y excitadores (responsable de las crisis convulsivas). Las crisis convulsivas de esta enfermedad se consiguen tratar con piridoxina a dosis farmacológicas, sin embargo, hasta un 75% de los pacientes presentan problemas relacionados con el neurodesarrollo. Dado que los compuestos neurotóxicos acumulados son los productos formados por la alfa aminoadipato semialdehído sintetasa humana (hAASS), se ha desarrollado un ensayo de actividad reductasa in vitro con la finalidad de una posterior identificación de compuestos inhibidores. Para ello, a partir de un plásmido comercial clonado con el cDNA que codifica para la hAASS (previamente amplificado y purificado) se llevó a cabo la expresión de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 en células HEK293T mediante un proceso de transfección química y se purificó en su forma activa mediante cromatografía de afinidad a Ni2+ y diálisis. Finalmente, se validó la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 mediante el desarrollo y optimización de un ensayo de absorbancia (monitorización del consumo de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato o NADPH), al que se acopló un ensayo de detección luminiscente para evitar interferencias de compuestos coloreados y aumentar la sensibilidadPyridoxine dependent epilepsy (PDE) is a rare disease caused by the mutation in ALDH7A1 gene which encodes for antiquitin (ATQ), an enzyme that participates in L-lysine degradative metabolism. Antiquitin deficiency produces catabolism interruption of aforementioned aminoacid, which leads to 5 the accumulation of toxic metabolites (responsibles for cognitive affectation) and the imbalance between inhibitory and excitatory neurotransmitters (responsible for convulsive crisis). The convulsive crisis of this disease can be trated with pharmacologic doses of pyridoxine nevertheless, up to 75% of patients show problems related with neurodevelopment. Due to neurotoxic compounds accumulated are the products formed by human alpha aminoadipic semialdehyde synthase (hAASS), a reductase activity in vitro assay has been developed with the purpose of the later identification of inhibitor compounds. For this, a commercial plasmid was cloned with cDNA which codifies for hAASS (previously amplified and purified), the recombinant protein hAASS-myc-His6 was expressed in HEK293T cells by a chemical transfection and purified in its active form through affinity chromatography to Ni2+ and dialysis. Finally, hAASS-myc-His6 reductase activity was validated by development and optimization of an absorbance assay (monitorization of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate or NADPH consumption), coupling a luminescent assay detection to avoid coloured compounds interferences and to increase sensitivityspaAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Epilepsia dependiente de piridoxinaL-lisinaDéficit cognitivohAASSReductasaInhibidoresPyridoxine dependent epilepsyL-lysineCognitive deficiencyReductaseInhibitors320903bachelor thesisopen access