Bermúdez Fornos, Icía2024-12-102024-12-102024-06https://hdl.handle.net/10347/38082Traballo Fin de Grao en Bioquímica. Curso 2023-2024[ESP] Klebsiella pneumoniae es una bacteria gram negativa incluida dentro del grupo ESKAPE y uno de los principales patógenos oportunistas causante de infecciones nosocomiales. La propagación de cepas que combinan hipervirulencia con multirresistencia a fármacos, hace necesario el desarrollo de métodos rápidos para la detección de este patógeno. Por ello, el objetivo de este trabajo fue el de desarrollar un método basado en la técnica molecular LAMP para la detección rápida de este patógeno en tres matrices biológicas: sangre, orina y leche. Para ello, se probaron y compararon cuatro métodos simples de extracción de ADN diferentes. Se optimizó el ensayo con chelex como método seleccionado para la extracción de ADN, y tras un enriquecimiento de las muestras de 6 horas, se obtuvo un límite de detección del 95% (LOD95) cercano a 2 UFC/mL para leche y orina, y a 5 UFC/mL para sangre. Finalmente, este método fue aplicable a LAMP colorimétrico con SYBR Green I como método de detección, obteniéndose un LOD95 cercano a 1 UFC/mL en sangre y orina, y a 3 UFC/mL en leche. Esto permitió llevar a cabo los ensayos LAMP en menos de una jornada laboral y con un equipamiento tan sencillo como un termobloque, lo que hace apta a la técnica para ser aplicada en puntos de interés.[GAL] Klebsiella pneumoniae é unha bacteria gram negativa incluída dentro do grupo ESKAPE e un dos principais patóxenos oportunistas causante de infeccións nosocomiais. A propagación de cepas que combinan hipervirulencia con multirrestencia a fármacos, fai necesario o desenvolvemento de métodos rápidos para a detección deste patóxeno. Por iso, o obxectivo deste traballo foi o de desenvolver un método baseado na técnica molecular LAMP para a detección rápida deste patóxeno en tres matrices biolóxicas: sangue, ouriños e leite. Para iso, probáronse e comparáronse catro métodos simples de extracción de ADN diferentes. Optimizouse o ensaio con chelex como método seleccionado para a extracción de ADN, e tras un enriquecemento das mostras de 6 horas, obtívose un límite de detección do 95% (LOD95) próximo a 2 UFC/mL para leite e ouriños, e a 5 UFC/mL para sangue. Finalmente, este método foi aplicable a LAMP colorimétrico con SYBR Green I como método de detección, obténdose un LOD95 próximo a 1 UFC/mL en sangue e ouriños, e a 3 UFC/mL en leite. Isto permitiu levar a cabo os ensaios LAMP en menos dunha xornada laboral e cun equipamento tan sinxelo como un termobloque, o que fai apta á técnica para ser aplicada en puntos de interese.[ENG] Klebsiella pneumoniae is a gram-negative bacterium that is included in the ESKAPE group and one of the main opportunistic pathogens causing nosocomial diseases. The spread of strains that combine hypervirulence with multidrug resistance, makes it necessary to develop rapid methods for the detection of this pathogen. Thus, the aim of this study was to develop a method based in the molecular technique LAMP for the rapid detection of this pathogen in three biological matrices: blood, urine and milk. To this end, four different simple methods for DNA extraction were tested and compared. The assay was optimised with chelex as the selected method for DNA extraction, and after a 6 hours enrichment of the samples, a limit of detection of 95% (LOD95) close to 2 CFU/mL was obtained for milk and urine, and close to 5 CFU/mL for blood. Finally, this method was applicable to colorimetric LAMP with SYBR Green I as the detection method, achieving a LOD95 close to 1 CFU/mL in blood and urine, and 3 CFU/mL in milk. This allowed the LAMP assays to be carried out in less than a working day and with equipment as simple as a thermal block, making the technique suitable for point-of-care applications.spaAttribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 Internationalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/LAMPKlebsiella pneumoniaeDetección rápida de patógenosESKAPEExtracción ADNChelexSangreOrinaLecheDetección rápida de patóxenosSangueOuriñosLeiteRapid pathogen detectionDNA extractionBloodUrineMilkbachelor thesisopen access