RT Generic
T1 Desarrollo de un ensayo in vitro para la identificación de compuestos inhibidores de la actividad reductasa de la hAASS, diana terapéutica de la epilepsia dependiente de piridoxina
T2 Development of an in vitro assay for the identification of compounds that inhibit reductase activity of hAASS, therapeutic target of pyridoxine dependent epilepsy
A1 Cabanas Trevin, Lucía
K1 Epilepsia dependiente de piridoxina
K1 L-lisina
K1 Déficit cognitivo
K1 hAASS
K1 Reductasa
K1 Inhibidores
K1 Pyridoxine dependent epilepsy
K1 L-lysine
K1 Cognitive deficiency
K1 Reductase
K1 Inhibitors
AB La epilepsia dependiente de piridoxina (EDP) es una enfermedad rara producida por la mutación en elgen ALDH7A1 que codifica para la antiquitina (ATQ), una enzima que participa en el metabolismodegradativo de la L-lisina. El déficit de antiquitina produce una interrupción del catabolismo de dichoaminoácido, que se traduce en la acumulación de metabolitos tóxicos (responsables de la afectacióncognitiva) y en el desequilibrio entre neurotransmisores inhibidores y excitadores (responsable de lascrisis convulsivas). Las crisis convulsivas de esta enfermedad se consiguen tratar con piridoxina a dosisfarmacológicas, sin embargo, hasta un 75% de los pacientes presentan problemas relacionados con elneurodesarrollo.Dado que los compuestos neurotóxicos acumulados son los productos formados por la alfaaminoadipato semialdehído sintetasa humana (hAASS), se ha desarrollado un ensayo de actividadreductasa in vitro con la finalidad de una posterior identificación de compuestos inhibidores. Para ello,a partir de un plásmido comercial clonado con el cDNA que codifica para la hAASS (previamenteamplificado y purificado) se llevó a cabo la expresión de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 encélulas HEK293T mediante un proceso de transfección química y se purificó en su forma activamediante cromatografía de afinidad a Ni2+ y diálisis. Finalmente, se validó la actividad reductasa de lahAASS-myc-His6 mediante el desarrollo y optimización de un ensayo de absorbancia (monitorizacióndel consumo de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato o NADPH), al que se acopló un ensayo dedetección luminiscente para evitar interferencias de compuestos coloreados y aumentar lasensibilidad
AB Pyridoxine dependent epilepsy (PDE) is a rare disease caused by the mutation in ALDH7A1 gene whichencodes for antiquitin (ATQ), an enzyme that participates in L-lysine degradative metabolism.Antiquitin deficiency produces catabolism interruption of aforementioned aminoacid, which leads to5the accumulation of toxic metabolites (responsibles for cognitive affectation) and the imbalancebetween inhibitory and excitatory neurotransmitters (responsible for convulsive crisis). The convulsivecrisis of this disease can be trated with pharmacologic doses of pyridoxine nevertheless, up to 75% ofpatients show problems related with neurodevelopment.Due to neurotoxic compounds accumulated are the products formed by human alpha aminoadipicsemialdehyde synthase (hAASS), a reductase activity in vitro assay has been developed with thepurpose of the later identification of inhibitor compounds. For this, a commercial plasmid was clonedwith cDNA which codifies for hAASS (previously amplified and purified), the recombinant proteinhAASS-myc-His6 was expressed in HEK293T cells by a chemical transfection and purified in its activeform through affinity chromatography to Ni2+ and dialysis. Finally, hAASS-myc-His6 reductase activitywas validated by development and optimization of an absorbance assay (monitorization ofNicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate or NADPH consumption), coupling a luminescent assaydetection to avoid coloured compounds interferences and to increase sensitivity
YR 2022
FD 2022
LK http://hdl.handle.net/10347/30354
UL http://hdl.handle.net/10347/30354
LA spa
DS Minerva
RD 24 abr 2026