Nuevas estrategias proteómicas para la caracterización de proteinas de baja abundancia en muestras clínicas

Abstract

La enfermedad de Alzheimer es un proceso neurodegenerativo del sistema nervioso central caracterizada por la muerte neuronal progresiva en ciertas áreas del cerebro. Esta enfermedad es el tipo más habitual de demencia, que en 2013 contaba con 44 millones de afectados y se estima que aumente a 65 millones en 2030. Actualmente, la muestra clínica más estudiada es el líquido cefalorraquídeo, por lo que el hallazgo de biomarcadores indicadores de la enfermedad en muestras cuya obtención sea más sencilla se presenta como una interesante alternativa a estudiar. En este trabajo se han desarrollado y estandarizado diferentes técnicas para el estudio de muestras de suero, centrándose en el campo de la proteómica, realizando la separación de las proteínas de alta abundancia de las de baja abundancia por cromatografía de afinidad, para la subsiguiente separación de éstas por electroforesis bidimensional 2D-PAGE. Se han estudiado las diferentes condiciones de electroforesis (nativas o desnaturalizantes), el pH de las tiras o la dilución de la muestra; y con respecto a los geles de poliacrilamida su tinción, el grado de polimeración, el tamaño y el secado. Las metodologías se aplicaron a muestras de personas sanas, pacientes con deterioro cognitivo que evolucionaría a Alzheimer y pacientes con Alzheimer, realizando un análisis de imagen comparativo de estas situaciones.A enfermidade de Alzheimer é un proceso neurodexenerativo do sistema nervioso central caracterizada pola morte neuronal progresiva en certas áreas do cerebro. Esta enfermidade é o tipo máis habitual de demencia, que en 2013 contaba con 44 millóns de afectados e estímase que aumente a 65 millóns en 2030. Actualmente, a mostra clínica máis estudada é o líquido cefalorraquídeo, polo que o achado de biomarcadores indicadores da enfermidade en mostras cuxa obtención sexa máis sinxela preséntase como una interesante alternativa a estudar. Neste traballo desenvolvéronsee estandarizáronse diferentes técnicas para o estudo de mostras de soro, centrándose no campo da proteómica, realizando a separación das proteínas de alta abundancia das de baixa abundancia por cromatografía de afinidade, para a subseguinte separación destas por electroforese bidimensional 2D-PAGE. Estudáronse diferentes condicións de electroforese (nativas ou desnaturalizantes), o pH da tira ou a dilución da mostra; e con respecto aos xeles de poliacrilamida a tinción, o grado de polimerización, o tamaño e o secado. As metodoloxías foron aplicadas a mostras de persoas sas, pacientes con deterioro cognitivo que evolucionaría a Alzheimer e pacientes con Alzheimer, realizando unha análise de imaxe comparativa destas situaciónsAlzheimer ́s diseaseis a neurodegenerative process of the central nervous system characterized by progressive neuronal death in certain areas of the brain. This disease is the most common type of dementia, which affected 44 million people in 2013. This number is estimated to increase to 65 million in 2030. Currently, the most studied clinical sample is cerebrospinal fluid, so the finding of biomarkers of thisdisease in samples whose extraction is simpler is presented as an interesting alternative to study. For this purpose, different techniques for the study of serum samples have been developed and standardized, focusing on the field of proteomics. The separation of high abundance proteins from low abundance ones is carried out by affinity chromatography, for the subsequent separation by 2D-PAGE two-dimensional electrophoresis. Different electrophoresis conditions have been tested (native or denaturing), as well as the pH of the strips and the dilution of the sample; and with respect to the polyacrylamide gels their staining, degree of polymerization, size and drying. The methodologies were applied to samples of healthy individuals, patients with cognitive impairment that would evolve to Alzheimer's and Alzheimer'spatients, performing a comparative image analysis of these situations.