Identificación y caracterización de genes de virulencia en Photobacterium damselae subsp. damselae: un patógeno de la acuicultura marina

Abstract

La bacteria marina Photobacterium damselae subsp. damselae es considerada un patógeno primario de una amplia variedad de especies de peces de interés en acuicultura. Además, es responsable de septicemias hemorrágicas letales en seres humanos, evidenciando su potencial zoonótico. Estudios recientes han puesto de manifiesto que el carácter altamente hemolítico de ciertas cepas de P. damselae subsp. damselae es debido a la presencia del plásmido pPHDD1(150 Kb). Dicho elemento móvil codifica dos hemolisinas: la fosfolipasa D damselisina (Dly) y la hemolisina formadora de poro fobalisina (PhlyP), las cuales juegan un papel crucial en la virulencia para animales homeotermos y poiquilotermos. Cabe destacar que el plásmido pPHDD1 se limita a tan solo una pequeña fracción de las cepas aisladas de brotes en cultivos de peces. Las cepas sin plásmido también presentan una menor actividad hemolítica, debida a la presencia de una toxina cromosómica (PhlyC). A pesar de que las cepas carentes de pPHDD1 son comúnmente aisladas como responsables de brotes en plantas acuícolas, hasta la fecha no se han realizado estudios genéticos destinados a la búsqueda de factores de virulencia adicionales. En el presente estudio, demostramos que la hemolisina PhlyC codificada en el cromosoma I juega un papel en la virulencia y en la citotoxicidad en cepas de P. damselae subsp. damselae carentes de pPHDD1. Además, combinando la secuenciación completa de genomas con la obtención de mutantes por deleción de genes candidatos, hemos identificado dos genes que hasta la fecha no habían sido caracterizados en esta subespecie, y que codifican respectivamente una colagenasa (ColP) y una fosfolipasa (PlpV). Mientras que el gen colP está presente en una fracción pequeña de los aislados estudiados, plpV está presente en todas las cepas. Asimismo, basándonos en la técnica de transposición con mini-Tn10, localizamos al gen lip80 como responsable de la actividad lipolítica detectada en el medio tween 80 en la mayoría de las cepas de P. damselae subsp. damselae. Consecuente con la predicción de péptidos señal en las secuencias aminoacídicas de PhlyC, ColP y PlpV, mutantes para los genes epsL y pilD del Sistema de Secreción de tipo II mostraron una disminución total en la producción de la hemolisina PhlyC y la fosfolipasa PlpV, y parcial de la colagenasa ColP. Datos que ponen de manifiesto la secreción de este tipo de enzimas a través del Sistema de Secreción de tipo II. En contraposición, la enzima lipolítica Lip80 no es translocada al medio extracelular a través de esta vía. Asimismo, ensayos de virulencia en lubina y de citotoxicidad para cultivos celulares de peces y de humanos con los mutantes para diferentes combinaciones de genes, demostraron que hlyAcr, colP y plpV contribuyen a la virulencia y toxicidad celular, siendo los mutantes para hlyAcr y plpV los que exhibieron una mayor reducción en la virulencia en peces. Nuestros resultados confirman el potencial patogénico de las cepas de P. damselae subsp. damselae carentes del plásmido pPHDD1 y demuestran el papel de la hemolisina PhlyC, la fosfolipasa ubicua PlpV y la colagenasa ColP en la virulencia para lubina, y de PhlyC y PlpV en la toxicidad celular para cultivos celulares de peces y humanos.