Búsqueda, clonación y expresión de genes de carotenogénesis

Abstract

Se realizó la búsqueda, clonación y expresión de los genes ζ-caroteno desaturasa (zds-Fc) y licopeno β-ciclasa (β-lyc-Fc) de Ficus carica. Estos genes catalizaron la desaturación del ζ- caroteno y neurosporeno para producir licopeno, y la ciclación del licopeno para producir β- caroteno, respectivamente. El gen zds-Fc presentó un marco de lectura abierto de 1746 pb que codifica una proteína de 582 aminoácidos con un peso molecular de 64 kD. El gen β-lyc-Fc presentó un marco de lectura abierto de 1488 bp que codifica un polipéptido de 496 aminoácidos con un peso molecular de 56 kD. El análisis de sus secuencias reveló una alta homología y motivos conservados con otras desaturasas y ciclasas descritas en plantas. El análisis de la actividad enzimática se realizó mediante ensayos de complementación heteróloga en Escherichia coli y se confirmó por HPLC-PDA. Hasta ahora, estos son los primeros genes de carotenogénesis descritos en F. carica. Como ensayo en sistema eucariota, se construyeron tres nuevas cepas recombinantes de Pichia pastoris, (Pp-EBI, Pp-EBIL, Pp-EBILWZ) capaces de producir licopeno, β-caroteno y astaxantina, respectivamente. Para esto, se diseñaron y construyeron los plásmidos recombinantes, pGAPZA-EBI*, pGAPZA-EBI*L*, pGAPZA-WZ que contenían los genes, geranilgeranil difosfato sintetasa (crtE), fitoeno sintetasa (crtB) y fitoeno desaturasa (crtI) de Erwinia uredovora, licopeno β-ciclasa (crtL o β-lyc-Fc) de F. carica, y β-caroteno ketolasa (crtW) y β-caroteno hidroxilasa (crtZ) de Agrobacterium aurantiacum. Finalmente, se logró por primera vez en la levadura P. pastoris la producción de β-caroteno y astaxantina, aportando una fuente microbiológica alternativa para la biosíntesis de carotenoides.